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1、實驗原理:
(1)、細(xi)菌生化試驗(yan):
各(ge)種細(xi)菌(jun)(jun)所具(ju)有的(de)(de)酶系統不(bu)盡相同,對(dui)(dui)營養基質(zhi)的(de)(de)分解能力也(ye)不(bu)一樣,因而(er)代(dai)謝(xie)產物或(huo)多或(huo)少地各(ge)有區別(bie),可供鑒(jian)別(bie)細(xi)菌(jun)(jun)之用(yong).用(yong)生化試(shi)驗的(de)(de)方法(fa)檢測細(xi)菌(jun)(jun)對(dui)(dui)各(ge)種基質(zhi)的(de)(de)代(dai)謝(xie)作用(yong)及其代(dai)謝(xie)產物,從而(er)鑒(jian)別(bie)細(xi)菌(jun)(jun)的(de)(de)種屬,稱(cheng)之為細(xi)菌(jun)(jun)的(de)(de)生化反應(ying).
(2)、糖(醇)類發酵試(shi)驗(yan):
不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)細(xi)菌含有(you)發(fa)酵不(bu)同(tong)糖(醇)的(de)(de)(de)酶,因而發(fa)酵糖(醇)的(de)(de)(de)能力各(ge)不(bu)相同(tong).其產生的(de)(de)(de)代謝(xie)產物亦不(bu)相同(tong),如有(you)的(de)(de)(de)產酸(suan)產氣(qi),有(you)的(de)(de)(de)產酸(suan)不(bu)產氣(qi).酸(suan)的(de)(de)(de)產生可利(li)用指示(shi)劑來判定.在配制(zhi)培養基時預(yu)先加(jia)入溟甲(jia)酚紫［P HS. 2(黃色)一6 . 8 (紫色)],當(dang)發(fa)酵產酸(suan)時,可使(shi)培養基由紫色變為黃色.氣(qi)體(ti)產生可由發(fa)酵管中倒(dao)置(zhi)的(de)(de)(de)杜氏小管中有(you)無氣(qi)泡(pao)來證明.
(3)、甲基紅(Methylred)試驗(yan)(該試驗(yan)簡(jian)稱MR試驗(yan)):
很多細菌(jun),如大腸桿菌(jun)等分解葡萄(tao)糖產生丙酮(tong)(tong)酸(suan)(suan)(suan),丙酮(tong)(tong)酸(suan)(suan)(suan)再(zai)被分解,產生甲酸(suan)(suan)(suan)、乙(yi)酸(suan)(suan)(suan)、乳酸(suan)(suan)(suan)等,使培(pei)養基的pH 降低到4 . 2 以下,這(zhe)時若加(jia)甲基紅(hong)(hong)(hong)指示劑(ji)呈現紅(hong)(hong)(hong)色(se).因(yin)甲基紅(hong)(hong)(hong)指示劑(ji)變色(se)范圍是pH4 . 4 (紅(hong)(hong)(hong)色(se))一(yi)pH6 . 2 (黃色(se)).若某些細菌(jun)如產氣桿菌(jun),分解葡萄(tao)糖產生丙酮(tong)(tong)酸(suan)(suan)(suan),但很快將丙酮(tong)(tong)酸(suan)(suan)(suan)脫(tuo)梭(suo),轉化成醇等物(wu),則培(pei)養基的pH 仍在6 . 2 以上,故此時加(jia)入甲基紅(hong)(hong)(hong)指示劑(ji),呈現黃色(se).
(4)、大分子物(wu)質代(dai)謝實驗:
靛(dian)基質(口引睬)試驗(yan):
某些細菌,如大腸桿菌,能分(fen)解(jie)蛋白質中的色(se)氨酸,產生靛基(ji)(ji)質(叫睬),靛基(ji)(ji)質與(yu)對二甲(jia)基(ji)(ji)氨基(ji)(ji)苯甲(jia)醛(quan)結(jie)合,形成玫瑰色(se)靛基(ji)(ji)質(紅(hong)色(se)化合物).
硫(liu)化(hua)氫試驗:
某些細菌能分(fen)解含硫(liu)(liu)的氨基酸(suan)(肌(ji)氨酸(suan)、半肌(ji)氨酸(suan)等),產生硫(liu)(liu)化氫,硫(liu)(liu)化氫與培養基中的鉛鹽或鐵(tie)鹽,形(xing)成黑色沉淀硫(liu)(liu)化鉛或硫(liu)(liu)化鐵(tie).為硫(liu)(liu)化氫試驗(yan)陽性(xing),可(ke)借以鑒別(bie)細菌.
明膠液化實驗:
某些細菌(jun)具有膠原酶,使明(ming)膠被分解,失去(qu)凝固能(neng)力(li),呈現液體狀(zhuang)態(tai),是為陽性.
粉水解(jie)試(shi)驗(yan)(在紫外(wai)誘變中做,本實驗(yan)不做):
細菌(jun)對大(da)分(fen)子(zi)的(de)淀(dian)粉(fen)不(bu)(bu)能直接利用(yong),須靠產生的(de)胞外酶(淀(dian)粉(fen)酶)將淀(dian)粉(fen)水(shui)解為小分(fen)子(zi)糊精(jing)或進一(yi)步水(shui)解為葡萄糖(或麥(mai)芽糖),再(zai)被細菌(jun)吸收利用(yong),細菌(jun)水(shui)解淀(dian)粉(fen)的(de)過程(cheng)可通過底物的(de)變化來證明,即用(yong)碘測定不(bu)(bu)再(zai)產生藍色(se).
(5)、有機酸(suan)鹽(yan)及氨(an)鹽(yan)利用試(shi)驗:
檸檬酸(suan)鹽利用試驗:
檸(ning)檬(meng)(meng)酸(suan)鹽培(pei)(pei)養基(ji)(ji)系一綜合性(xing)(xing)培(pei)(pei)養基(ji)(ji),其(qi)中檸(ning)檬(meng)(meng)酸(suan)鈉(na)為碳的唯一來源(yuan).而磷酸(suan)二氫按是氮的唯一來源(yuan).有的細菌如產(chan)氣(qi)桿菌,能(neng)利(li)用檸(ning)檬(meng)(meng)酸(suan)鈉(na)為碳源(yuan),因此能(neng)在檸(ning)檬(meng)(meng)酸(suan)鹽培(pei)(pei)養基(ji)(ji)上(shang)生長,并分(fen)解檸(ning)檬(meng)(meng)酸(suan)鹽后(hou)產(chan)生碳酸(suan)鹽,使培(pei)(pei)養基(ji)(ji)變(bian)為堿性(xing)(xing).此時培(pei)(pei)養基(ji)(ji)中的溟廖香草酚藍(lan)指示劑由綠(lv)色變(bian)為深藍(lan)色.不能(neng)利(li)用檸(ning)檬(meng)(meng)酸(suan)鹽為碳源(yuan)的細菌,在該(gai)培(pei)(pei)養基(ji)(ji)上(shang)不生長,培(pei)(pei)養基(ji)(ji)不變(bian)色.
2、實驗儀器,材料和用具:
(1)實(shi)驗儀(yi)器:
37℃恒溫培養箱、20℃恒溫培養箱(室溫代替).
(2)微生物材料:
大(da)腸(chang)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)、變形桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)、枯草桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)、產(chan)氣桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)這(zhe)四種菌(jun)(jun)(jun)種的斜面各1支.
(3)試劑:
甲基紅(hong)試劑、VP試劑、叫噪試劑、格里斯試劑(硝酸鹽利用試驗(yan))、盧戈氏(shi)碘液(ye)(淀粉水解(jie)試驗(yan))
(4)實驗(yan)用具:
試管:每(mei)份(fen)每(mei)個(ge)試驗2根(gen)試驗,1 根(gen)對照,8個(ge)試驗共(gong)27根(gen).
無菌(jun)平皿(min):每份2個
杜(du)氏小管:每份6個.
接種環、酒精(jing)燈、試管架(jia)、記號筆.
(5)培(pei)養基:
①葡萄糖(tang)發(fa)酵培養(yang)基(ji)和乳糖(tang)發(fa)酵培養(yang)基(ji):何份(fen)各6支試管,何支5 一(yi)10mi 培養(yang)基(ji),滅菌.用于糖(tang)類發(fa)酵試驗(yan).
②葡萄糖蛋白陳水(shui)培(pei)養(yang)基:每份3 支試(shi)管(guan),何支5一10mi培(pei)養(yang)基,滅菌(jun).用于甲(jia)基紅和VP試(shi)驗.
③胰蛋白(bai)水培養(yang)基(ji):每份3支(zhi)何支(zhi)5一10mi培養(yang)基(ji),滅(mie)菌.用于叫睬試驗(yan).
④檸(ning)檬(meng)酸(suan)鐵錢(qian)或醋酸(suan)鉛的半固體(ti)培養基;每(mei)份3 支,每(mei)支5 一10ml 培養基,滅菌.用(yong)于硫化(hua)氫試(shi)驗.
⑤營養明膠培養基:每份3支,每支5一(yi)10ml培養基、滅菌(jun).用(yong)于(yu)明膠液(ye)化試驗.
⑥淀(dian)粉(fen)培養基:每(mei)份2個平(ping)皿,每(mei)平(ping)皿約20ml培養基,滅菌后倒入平(ping)皿.用于淀(dian)粉(fen)水解(jie)試驗.
⑦檸檬酸(suan)鈉(na)培(pei)養(yang)基(ji):每(mei)份3支,每(mei)支5 一10ml培(pei)養(yang)基(ji),滅菌,做斜(xie)面(mian).用于檸檬酸(suan)鹽利用試驗.
3、實驗步驟:
(1)糖(tang)(醇)類發酵試(shi)驗:
編(bian)號(hao)在各試管上分別標明發酵培養(yang)基名稱,所接種(zhong)的菌(jun)名和(he)組號(hao),下(xia)同.
接(jie)種(zhong)(zhong)取葡(pu)萄糖發酵培養(yang)基(ji)3支,按編號1 支接(jie)種(zhong)(zhong)大腸桿(gan)菌(jun),另(ling)1支接(jie)種(zhong)(zhong)普通(tong)變形桿(gan)菌(jun),第3支不接(jie)種(zhong)(zhong),作為(wei)對照(zhao)(zhao)C同(tong)樣取3支乳糖發酵培養(yang)基(ji),1支接(jie)種(zhong)(zhong)大腸桿(gan)菌(jun),1支接(jie)科普通(tong)變形桿(gan)菌(jun),第3支不接(jie)種(zhong)(zhong),作為(wei)對照(zhao)(zhao).
將己(ji)接種好的培(pei)(pei)養基置(zhi)37℃溫箱中培(pei)(pei)養24h.
觀察結(jie)果(guo):被檢細菌(jun)若能發(fa)酵培(pei)(pei)(pei)養基中的(de)糖時,則(ze)使培(pei)(pei)(pei)養基的(de)pH 降低(di),這(zhe)時培(pei)(pei)(pei)養基中的(de)指示劑呈酸(suan)性反應(為黃色),若發(fa)酵培(pei)(pei)(pei)養基中的(de)糖產酸(suan)產氣,則(ze)培(pei)(pei)(pei)養基不僅顯酸(suan)色反應,并且(qie)在培(pei)(pei)(pei)養基中倒(dao)置的(de)小(xiao)(xiao)玻(bo)璃管(guan)(杜氏(shi)小(xiao)(xiao)管(guan))中有(you)氣體(ti).氣體(ti)占整個倒(dao)置小(xiao)(xiao)玻(bo)管(guan)的(de)10％以上.若被檢細菌(jun)不分解培(pei)(pei)(pei)養基中的(de)糖,則(ze)培(pei)(pei)(pei)養基不發(fa)生變化(hua).
(2)甲基(ji)紅(hong)試(shi)驗(MR試(shi)驗):
將大腸桿(gan)菌(jun)和產氣桿(gan)菌(jun)分別(bie)接種到葡萄糖蛋白(bai)陳水培養基中,37℃培養48h,加甲基紅指(zhi)示劑(ji)數滴,觀察結果,呈現紅色(se)者(zhe)為(wei)陽性(xing)(xing),呈現黃(huang)色(se)者(zhe)為(wei)陰性(xing)(xing).
(3)伏一普二氏試驗(yan)(VP試驗(yan)):
將(jiang)被檢菌(jun)接種(zhong)到葡萄(tao)糖蛋白陳水培養基中,37℃培養48h ,取出,加(jia)(jia)入(ru)(ru)40 % KOlls一(yi)10滴,然后再加(jia)(jia)入(ru)(ru)等量的5％.一(yi)蔡酚溶液,用力振蕩,再放入(ru)(ru)37℃溫箱中保(bao)溫巧一(yi)30min ,以加(jia)(jia)快反應速度(du).若培養物(wu)呈(cheng)現紅色(se),為伏一(yi)普反應陽性(xing).
(4)靛基質(口引噪)試驗:
將被(bei)檢菌接(jie)種到胰(yi)蛋白陳水培(pei)養(yang)基中,37℃培(pei)養(yang)24h 一48h 后,沿試管壁(bi)滴(di)加數滴(di)叫睬試劑于培(pei)養(yang)物液面,觀(guan)察結果.
出(chu)(chu)現紅色者為陽性,出(chu)(chu)現黃色者為陰性.
(5)硫化氫試(shi)驗:
將(jiang)大腸桿菌(jun)和變(bian)形桿菌(jun)以接種針(zhen)穿刺接種到醋酸鉛或(huo)檸檬酸鐵(tie)氨培(pei)養基(ji)中,37℃培(pei)養24h ,觀察結果(guo),若有黑(hei)色(se)出(chu)現(xian)者(zhe)為陽性.
(6)明膠液化試(shi)驗:
取大腸(chang)桿菌(jun)和枯草桿菌(jun)的純培(pei)(pei)(pei)養(yang)物少許(xu),以接種針分別穿刺接種到營養(yang)明膠培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)(ji)中,置(zhi)(zhi)20℃培(pei)(pei)(pei)養(yang)5 一7 天.觀(guan)察明膠培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)(ji)液(ye)化情況.若被(bei)檢(jian)細菌(jun)20℃不易生長,可放37℃培(pei)(pei)(pei)養(yang),但(dan)在此溫度(du)下明膠培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)(ji)呈液(ye)狀,故觀(guan)察結果時,應(ying)將明膠培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)(ji)輕輕放入4℃冰箱30min ,此時明膠又(you)凝(ning)固.若放置(zhi)(zhi)于冰箱30min仍不凝(ning)固者,說明明膠被(bei)試驗細菌(jun)液(ye)化,是為陽性.
(7)淀粉水解(jie)試驗(yan):
將配(pei)制好的淀粉培養基冷(leng)卻到50℃左右,以無(wu)菌操作制成平板.
用接(jie)(jie)種環(huan)取少許枯草桿(gan)菌(jun)劃線(xian)(xian)接(jie)(jie)種在平板的一邊(bian),再取少許大腸桿(gan)菌(jun)劃線(xian)(xian)接(jie)(jie)種在平板的另一邊(bian).置37℃溫箱培養24h.
將平(ping)皿(min)取(qu)出,打(da)開皿(min)蓋,滴(di)加少量盧戈氏碘液于(yu)平(ping)板(ban)上(shang),輕(qing)輕(qing)搖動平(ping)皿(min),使碘液均(jun)勻鋪(pu)滿整個平(ping)板(ban).如菌苔周圍有無色透明圈出現,說明淀粉(fen)己被水解.透明圈的(de)大小(xiao)(xiao),說明該菌水解淀粉(fen)能(neng)力的(de)大小(xiao)(xiao).
(8)檸(ning)檬酸鹽利(li)用試驗:
取少量被檢菌(jun)接種(zhong)到檸檬酸鹽培養(yang)基上,37℃培養(yang)24h后,觀察結果.培養(yang)基變深藍色(se)者為(wei)陽性.培養(yang)基不變色(se),則(ze)繼續(xu)培養(yang)7天(tian),培養(yang)基仍不變色(se)者為(wei)陰性.
本文關鍵詞：細菌鑒(jian)定中常(chang)用(yong)的生(sheng)(sheng)理生(sheng)(sheng)化反應
