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一. 石蠟切片在染色(se)過(guo)程中出(chu)現脫片現象？
一(yi)般來說，如(ru)果用(yong)多(duo)聚賴氨酸包被過的(de)(de)片(pian)子(zi)(zi)做(zuo)正常免(mian)疫組(zu)織化學(xue)染色的(de)(de)話(hua)是不會掉片(pian)子(zi)(zi)的(de)(de)。但如(ru)果要做(zuo)抗(kang)原修復的(de)(de)話(hua)，如(ru)果片(pian)子(zi)(zi)處理(li)不好的(de)(de)話(hua)是有可能掉片(pian)子(zi)(zi)的(de)(de)。你可以試(shi)試(shi)一(yi)下的(de)(de)方法：
1.一般用(yong)APES：丙酮=1:50的處(chu)理(li)(li)液來處(chu)理(li)(li)片子，處(chu)理(li)(li)5min左右(you)，然后水(shui)洗，烘(hong)干既可用(yong)于貼片。如果把(ba)水(shui)滴再(zai)處(chu)理(li)(li)好的片子上，水(shui)比較聚的話說明(ming)片子處(chu)理(li)(li)的好。
2.貼(tie)片(pian)子(zi)的時(shi)候，展(zhan)片(pian)的時(shi)間要把握好，不要太長，否則不利(li)于貼(tie)牢(lao)。
3.烤片(pian)子也很重(zhong)要，切好的(de)片(pian)子最好先(xian)不要馬上收起(qi)來(lai)，而是(shi)水平至(zhi)于烘(hong)片(pian)臺上37度兩個小時以上，一是(shi)水分徹底烘(hong)干。然(ran)后做(zuo)染色前最好再(zai)在60度烘(hong)箱(xiang)烘(hong)1個小時。
4.再補充一(yi)點(dian) ，石蠟(la)包埋時，酒精梯(ti)度脫水以及浸蠟(la)等一(yi)點(dian)要充分，這對貼片也有影響(xiang)。
如(ru)果(guo)這些導致掉(diao)片的因素都(dou)已經(jing)排除但是片子還是掉(diao)的厲害，那么也可能是以下原因造成的：
1、多聚賴氨酸(suan)玻片質(zhi)量的問(wen)題(ti)。我原先是買的，邁新按說(shuo)也是不(bu)錯(cuo)的，可(ke)是都脫成什么樣子了。后面補(bu)做(zuo)(zuo)第二批時用的病理科老師(shi)自己做(zuo)(zuo)的片子，要好一點。
2、組織切(qie)(qie)的不(bu)(bu)好，切(qie)(qie)片(pian)機的問題例如(ru)比較老的舊(jiu)的機器切(qie)(qie)的厚或者(zhe)不(bu)(bu)均勻，或者(zhe)切(qie)(qie)片(pian)者(zhe)手(shou)法不(bu)(bu)好等。
3、組織(zhi)的(de)問題，我(wo)用的(de)組織(zhi)癌癥的(de)很(hen)多，越是癌癥組織(zhi)有壞(huai)死之類越容(rong)易脫。
4、沒烤好，時間短溫度不(bu)夠(gou)之類。
5、操作(zuo)的時(shi)候甩(shuai)(shuai)的太猛了(le)，有脫片嫌疑(yi)的片子最(zui)好不甩(shuai)(shuai)或輕輕甩(shuai)(shuai)，用衛生(sheng)紙(zhi)從邊(bian)緣上慢(man)慢(man)吸(xi)水。
6、修復的(de)問題：抗原修復的(de)時(shi)(shi)候高(gao)壓時(shi)(shi)間過長了，或者放進100度的(de)修復液時(shi)(shi)手(shou)法(fa)不好(hao)，咚的(de)一聲(sheng)就丟進去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復比(bi)檸檬酸(suan)容易脫片，但是(shi)你要用到EDTA的(de)時(shi)(shi)候也沒辦法(fa)，只有從另(ling)外的(de)問題上著手(shou)。
此外，一旦見到有組(zu)織漂起來操(cao)作就更加要謹慎，用PBS的(de)時候盡量(liang)用泡的(de)，不要沖。基本上把這些方面都注意到了，能改(gai)善(shan)的(de)盡量(liang)改(gai)善(shan)，脫片(pian)可以減少很多。
二. DAB顯色(se)后(hou)發現切片著色(se)不均(jun)勻：如(ru)一(yi)(yi)片著色(se)，一(yi)(yi)片不著色(se)或染色(se)淺？
著色不均勻(yun)可能與你(ni)的實驗手法有很大關系，可能原(yuan)因有：
1.切出(chu)的片(pian)子厚度本身可能就不一樣，切出(chu)一片(pian)厚，一片(pian)薄，這樣可能造(zao)成著色(se)深(shen)淺不一。
2.有(you)可能(neng)是(shi)你 顯色(se)液底(di)物加(jia)到片(pian)子(zi)(zi)上后沒(mei)有(you)搖勻，造成局部底(di)物濃(nong)度不一致，所以加(jia)完顯色(se)液后最(zui)好將(jiang)片(pian)子(zi)(zi)來(lai)回(hui)左(zuo)右晃動幾下，使(shi)片(pian)子(zi)(zi)上所有(you)區域(yu)的底(di)物濃(nong)度一致。
3.如果你(ni)的(de)(de)片子是中間的(de)(de)染色深，靠近(jin)邊上的(de)(de)淺，那(nei)有可能是你(ni)蠟圈畫(hua)的(de)(de)太小，顯色液(ye)覆(fu)蓋的(de)(de)面(mian)積不過大而產生(sheng)了邊緣效應。最(zui)外側的(de)(de)組織(zhi)片最(zui)好離顯色液(ye)外緣0.5cm。
三. 切片染色(se)后(hou)背(bei)景太(tai)深(shen)，不易區分特異性(xing)與非特異性(xing)著色(se)？
a.也許是抗體本(ben)身有問題，因為有很(hen)多公司的抗體質量(liang)并不好，很(hen)容易上(shang)背(bei)景，可以換(huan)一種(zhong)抗體 試試。
b.如果(guo)經費不(bu)允許換抗體(ti)的(de)話，你可降低抗體(ti)的(de)濃(nong)度(du)，并隨時(shi)注意觀察(cha)顯色，在能看到信號(hao)的(de)情況下盡量降低背景。
c.可以(yi)換一(yi)種(zhong)封閉(bi)液，不(bu)同(tong)的封閉(bi)液對某種(zhong)來(lai)源的抗體來(lai)說，會(hui)有不(bu)同(tong)的封閉(bi)效果(guo)。
d.可以在一(yi)抗和二抗中加入一(yi)定比例的(de)你(ni)所檢測(ce)動物(wu)組織的(de)正常血清，這樣可以去除一(yi)部分非特異性(xing)染色。
全片著色
全(quan)片著色(se)(se)是指整(zheng)個(ge)切片全(quan)都染上了顏色(se)(se)，著色(se)(se)的強度可深可淺，總之，分(fen)不(bu)清(qing)那些(xie)組(zu)織是陽性(xing)那些(xie)組(zu)織是陰性(xing)。出現這種(zhong)現象的原因有：
（1）抗體(ti)濃度(du)過高：一抗濃度(du)過高是(shi)常(chang)見的原因之一。解(jie)決辦法是(shi)，每次使(shi)用新抗體(ti)前應當對(dui)其(qi)工作濃度(du)進行測試，使(shi)每一抗體(ti)個體(ti)化，找到適合(he)自己實驗室的理想工作濃度(du)，既使(shi)是(shi)即用型的抗體(ti)也(ye)應如此(ci)，不能只簡單的按說明書進行染色。
（2）抗體孵(fu)育時(shi)(shi)(shi)間過長或溫度較高(gao)：解決辦(ban)法是(shi)，嚴格(ge)執行操作規程，最好隨身佩帶報(bao)時(shi)(shi)(shi)表或報(bao)時(shi)(shi)(shi)鐘，及(ji)時(shi)(shi)(shi)提醒，避免因遺(yi)忘而(er)造成時(shi)(shi)(shi)間延長。現在流行的(de)二(er)步法（Polymer）敏感性很高(gao)，要求(qiu)一抗孵(fu)育的(de)時(shi)(shi)(shi)間不是(shi)傳統的(de)1小時(shi)(shi)(shi)，而(er)是(shi)30分鐘，因此，要根據染色結果進行調整。
（3）DAB變質和顯(xian)色(se)(se)時(shi)(shi)(shi)間(jian)太長(chang)：DAB最(zui)好現用(yong)現配，如有沉渣應(ying)進行過濾后(hou)再用(yong)。配制好的(de)(de)(de)(de)DAB不應(ying)存放(fang)時(shi)(shi)(shi)間(jian)太長(chang)，因為(wei)在沒有酶(mei)的(de)(de)(de)(de)情(qing)況下(xia)，過氧(yang)化氫(qing)也(ye)會 游離出 氧(yang)原子與DAB產生反應(ying)而降低DAB的(de)(de)(de)(de)效力，未用(yong)完的(de)(de)(de)(de)DAB存放(fang)在冰箱里幾(ji)天(tian)后(hou)再用(yong)這種似乎(hu)節約的(de)(de)(de)(de)辦(ban)法(fa)是(shi)不可取(qu)的(de)(de)(de)(de)。DAB的(de)(de)(de)(de)顯(xian)色(se)(se)最(zui)好在顯(xian)微鏡下(xia)監控，達到 理想的(de)(de)(de)(de)染(ran)色(se)(se)程度時(shi)(shi)(shi)立即(ji)終(zhong)止反應(ying)。不過當染(ran)色(se)(se)片太多時(shi)(shi)(shi)或用(yong)染(ran)色(se)(se)機時(shi)(shi)(shi)，這樣做似乎(hu)不現實，但(dan)至少應(ying)對一些新的(de)(de)(de)(de)或少用(yong)的(de)(de)(de)(de)抗體顯(xian)色(se)(se)時(shi)(shi)(shi)進行監控，避免顯(xian)色(se)(se)時(shi)(shi)(shi)間(jian)過長(chang)。
（4）組織(zhi)變干：修(xiu)復液(ye)溢(yi)出后未及時補充液(ye)體(ti)(ti)、染色切片太多(duo)、動作(zuo)太慢、忘記滴液(ye)、滴液(ye)流失(shi)等都是造成組織(zhi)變干的(de)原因。解決的(de)辦法是操作(zuo)要認真仔細，采(cai)用(yong)DAKO筆或PAP Pen在組織(zhi)周(zhou)圍畫(hua)圈，可以(yi)有(you)效(xiao)的(de)避免液(ye)體(ti)(ti)流失(shi)，也(ye)能(neng)提高(gao)操作(zuo)速度。
（5）切(qie)片在(zai)緩沖液或修復液中浸泡(pao)時間(jian)太(tai)長（大于24小時）：原因(yin)上(shang)不(bu)清楚，但現象存在(zai)。有(you)的(de)實驗室(shi)喜歡前一天(tian)(tian)將切(qie)片脫蠟至修復，第(di)二天(tian)(tian)加抗體進行免疫(yi)組(zu) 化(hua)染 色，如果將裝(zhuang)有(you)切(qie)片和(he)修復液的(de)容器(qi)放(fang)在(zai)4?C冰箱(xiang)過夜，對結果無(wu)明顯(xian)影(ying)響(xiang)，如果放(fang)在(zai)室(shi)溫，特(te)別是炎熱的(de)夏天(tian)(tian)，會出現背景著(zhu)色，因(yin)此，不(bu)可存放(fang)時間(jian)太(tai) 長。
（6）一抗變(bian)質(zhi)、質(zhi)量差的(de)(de)多克隆抗體：注意抗體的(de)(de)有效(xiao)期，過(guo)期的(de)(de)抗體要麼(ma)(ma)不顯色要麼(ma)(ma)背景著(zhu)色。用(yong)新買的(de)(de)抗體時最好設立陽(yang)性對(dui)照和用(yong)使用(yong)過(guo)的(de)(de)抗體作比(bi)較。
四. 免疫組化結(jie)果(guo)老(lao)是出現陰性(xing)結(jie)果(guo)？
免疫組化出(chu)現(xian)陰性結果(guo)有可(ke)能組織(zhi)本(ben)身就沒有信(xin)號，也(ye)有可(ke)能是抗(kang)體出(chu)了問(wen)題(ti)。可(ke)以找一些(xie)陽性組織(zhi)做一下(xia)，以確定是抗(kang)體的問(wen)題(ti)還(huan)是組織(zhi)本(ben)身就沒有所檢測的抗(kang)原表達。還(huan)有，可(ke)以提高抗(kang)體的濃(nong)度，或(huo)者試(shi)一試(shi)抗(kang)原修(xiu)復等(deng)方法，也(ye)許會得到意想不到的結果(guo)。
五. 一抗從4度(du)拿出后，為什么(me)有(you)人(ren)說要(yao)37度(du)復溫，目的是什么(me)？
1. 一方面，防止切片(pian)從4度直接放入PBS易脫片(pian)；
2. 另(ling)一方面，使抗原抗體結(jie)合更穩定(ding)。一般不(bu)需(xu)要,但對表達較弱(ruo)的抗原可能(neng)有(you)用,4度(du)和37度(du)時(shi)分子運動(dong)方式不(bu)同,前者分子碰撞機率和運動(dong)速(su)度(du)小于后者,后者結(jie)合更快(kuai),但敏(min)感性也提(ti)高(gao)了并易(yi)造成非特異(yi)染色(se)。
六. 免(mian)疫組化中抗(kang)原修(xiu)復的最佳條件(jian)是(shi)什么？尤其(qi)是(shi)微波修(xiu)復。
關于抗原(yuan)修(xiu)(xiu)(xiu)(xiu)復(fu)，我個人的(de)(de)(de)觀點和panther75有(you)點不(bu)同。我試過的(de)(de)(de)修(xiu)(xiu)(xiu)(xiu)復(fu)條(tiao)件(jian)有(you)EDTA熱(re)修(xiu)(xiu)(xiu)(xiu)復(fu)，檸檬(meng)酸鈉為緩沖液的(de)(de)(de)微波(bo)修(xiu)(xiu)(xiu)(xiu)復(fu)以及高壓鍋(guo)修(xiu)(xiu)(xiu)(xiu)復(fu)。從我的(de)(de)(de)實驗結果 來看，微波(bo)修(xiu)(xiu)(xiu)(xiu)復(fu)其實很不(bu)容易掉(diao)片(pian)(pian)子(zi)的(de)(de)(de)，而EDTA熱(re)修(xiu)(xiu)(xiu)(xiu)復(fu)和高壓鍋(guo)修(xiu)(xiu)(xiu)(xiu)復(fu)是很容易掉(diao)片(pian)(pian)子(zi)的(de)(de)(de)。因(yin)(yin)為掉(diao)片(pian)(pian)子(zi)主要(yao)是因(yin)(yin)為加熱(re)過程中產生的(de)(de)(de)氣(qi)泡所引起(qi)，而微波(bo)修(xiu)(xiu)(xiu)(xiu)復(fu)水加 熱(re)到(dao)沸騰，沾在(zai)(zai)片(pian)(pian)子(zi)上(shang)(shang)的(de)(de)(de)氣(qi)泡就(jiu)會少，不(bu)會因(yin)(yin)為小氣(qi)泡上(shang)(shang)串引起(qi)脫(tuo)片(pian)(pian)。做EDTA修(xiu)(xiu)(xiu)(xiu)復(fu)時，你可以將(jiang)片(pian)(pian)子(zi)靠的(de)(de)(de)盡(jin)量近些，或是在(zai)(zai)載玻片(pian)(pian)四周墊些棉(mian)花什么的(de)(de)(de)，然(ran)后蓋 上(shang)(shang)蓋玻片(pian)(pian)，這(zhe)樣修(xiu)(xiu)(xiu)(xiu)復(fu)的(de)(de)(de)話就(jiu)能夠盡(jin)量減(jian)少載玻片(pian)(pian)上(shang)(shang)小氣(qi)泡的(de)(de)(de)形成。
我(wo)們(men)用的(de)微波修(xiu)復條件為：
2.94g檸檬酸三鈉(na)溶于1000ml的水，調ph值(zhi)至6.0，微波修(xiu)復10分鐘。你(ni)可(ke)(ke)以試(shi)試(shi)，時間(jian)可(ke)(ke)以根據需要(yao)自己調整。
七. 有(you)人在一抗孵(fu)育前(qian)用tritonX100來通透細胞，對石蠟切(qie)片需要否？
用石蠟切片(pian)做免疫組化是(shi)不需要透膜處理的，一(yi)(yi)是(shi)因為石蠟切片(pian)比較薄，另(ling)外一(yi)(yi)個原因我認為是(shi)在包埋過程中細胞膜已經被破壞，所以這一(yi)(yi)步可(ke)以省略。
八(ba). 蘇木素(su)復(fu)染(ran)的時間應該(gai)是(shi)多(duo)少？復(fu)染(ran)過度咋辦？
復(fu)染時(shi)間不(bu)需要(yao)太長，當然這也要(yao)根據蘇(su)木精(jing)的(de)質(zhi)量來確定，但(dan)基(ji)本上不(bu)要(yao)超多一(yi)分(fen)(fen)鐘。染色(se)過深的(de)話可以用(yong)酸(suan)性(xing)的(de)水(shui)溶(rong)液（在(zai)(zai)水(shui)里滴(di)加少量濃鹽酸(suan)）分(fen)(fen)色(se)，分(fen)(fen)色(se)的(de)另(ling) 外一(yi)個目的(de)是(shi)洗掉蘇(su)木精(jing)在(zai)(zai)細(xi)胞質(zhi)中的(de)非(fei)特(te)異(yi)性(xing)結(jie)合，這樣(yang)可以使(shi)細(xi)胞質(zhi)中的(de)特(te)異(yi)信(xin)號更(geng)明顯。所以不(bu)管復(fu)染是(shi)不(bu)是(shi)過度，分(fen)(fen)色(se)這一(yi)步(bu)最好不(bu)要(yao)省掉。分(fen)(fen)色(se)后記得再 用(yong)氨(an)水(shui)返(fan)藍一(yi)下。
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