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黃曲霉毒素M1免疫親和柱操作說明書
【概要】
黃曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)毒(du)(du)素(su)(su)（Aflatoxin）是(shi)黃曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)、寄生(sheng)曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)等真菌產(chan)(chan)生(sheng)的(de)(de)(de)(de)次級代(dai)(dai)謝產(chan)(chan)物，被(bei)世(shi)(shi)界(jie)衛(wei)生(sheng)組(zu)織(zhi)的(de)(de)(de)(de)癌(ai)(ai)癥(zheng)研究機構(gou)劃分為(wei)1類(lei)致癌(ai)(ai)物，同(tong)時又是(shi)一(yi)種(zhong)毒(du)(du)性(xing)極強的(de)(de)(de)(de)劇毒(du)(du)物質，廣泛(fan)存(cun)在于各種(zhong)食(shi)物中(zhong)。玉米(mi)，花生(sheng)，大米(mi)，小麥等谷物及其副產(chan)(chan)品(pin)是(shi)黃曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)毒(du)(du)素(su)(su)的(de)(de)(de)(de)主(zhu)(zhu)要來源，同(tong)時飼料中(zhong)的(de)(de)(de)(de)黃曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)毒(du)(du)素(su)(su)B1經(jing)過(guo)動物代(dai)(dai)謝后產(chan)(chan)生(sheng)的(de)(de)(de)(de)黃曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)毒(du)(du)素(su)(su)M1仍然(ran)具有很(hen)強的(de)(de)(de)(de)毒(du)(du)性(xing)和致癌(ai)(ai)性(xing)，也(ye)廣泛(fan)存(cun)在牛奶，血液，組(zu)織(zhi)等食(shi)品(pin)中(zhong)。黃曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)毒(du)(du)素(su)(su)作(zuo)為(wei)肝癌(ai)(ai)的(de)(de)(de)(de)三大誘因(yin)(yin)之(zhi)一(yi)，也(ye)是(shi)胃癌(ai)(ai)，腸癌(ai)(ai)等疾病的(de)(de)(de)(de)主(zhu)(zhu)要原因(yin)(yin)，對人類(lei)的(de)(de)(de)(de)健康構(gou)成很(hen)大威脅。世(shi)(shi)界(jie)各國對食(shi)品(pin)，飼料中(zhong)的(de)(de)(de)(de)黃曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)毒(du)(du)素(su)(su)都(dou)有嚴格的(de)(de)(de)(de)限量(liang)標(biao)準。2010年6月1日開始施行(xing)的(de)(de)(de)(de)乳品(pin)安全(quan)國家標(biao)準中(zhong)對乳和乳制品(pin)中(zhong)黃曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)毒(du)(du)素(su)(su)M1的(de)(de)(de)(de)檢測(ce)進行(xing)了規定(ding)，主(zhu)(zhu)要使用的(de)(de)(de)(de)樣品(pin)前處理方法(fa)就(jiu)是(shi)免(mian)疫親和柱(zhu)凈化法(fa)。
【適用范圍及性能】
用(yong)于定性、定量(liang)檢測(ce)牛奶，奶粉，發酵(jiao)乳，干酪，奶油等樣品中黃曲霉毒(du)素M1的(de)樣品前(qian)處理。
柱容量：≥200ng
回收率(lv)：≥90%
【試驗原理】
本產品(pin)(pin)的測定的基礎(chu)是抗原抗體(ti)反應，黃(huang)曲霉(mei)(mei)毒(du)素M1單(dan)克(ke)隆抗體(ti)連接在柱(zhu)(zhu)(zhu)內凝(ning)膠上，樣品(pin)(pin)中(zhong)(zhong)的黃(huang)曲霉(mei)(mei)毒(du)素M1經過(guo)提取(qu)、過(guo)濾、稀(xi)釋，然后(hou)(hou)將樣品(pin)(pin)提取(qu)液緩(huan)慢的通過(guo)黃(huang)曲霉(mei)(mei)毒(du)素M1免疫親(qin)和(he)層析(xi)柱(zhu)(zhu)(zhu)，在免疫親(qin)和(he)柱(zhu)(zhu)(zhu)內，毒(du)素與抗體(ti)結(jie)合(he)，之(zhi)后(hou)(hou)洗(xi)(xi)滌免疫親(qin)和(he)柱(zhu)(zhu)(zhu)除去沒有被(bei)結(jie)合(he)的其他物質。用甲醇(chun)洗(xi)(xi)脫黃(huang)曲霉(mei)(mei)毒(du)素M1，然后(hou)(hou)注(zhu)入到分(fen)析(xi)儀器中(zhong)(zhong)用于檢測。
【包裝組成】
根據不同規格，每一(yi)個盒中包含(han)5-25支黃曲(qu)霉毒(du)素免(mian)疫親和(he)層析柱及1份說明書。
【需要而未提供的設備及試劑】
設備：
┅┅高速均質器或組織勻漿(jiang)機
┅┅粉碎機
┅┅200mL/50mL量筒
┅┅天平：感量0.1g
┅┅酸度計
┅┅分(fen)液漏(lou)斗
┅┅微(wei)量移液器：單道 100?L～1000?L
┅┅槽紋濾紙（折疊快速定性或定量濾紙）
┅┅50mL漏斗
┅┅旋轉蒸發儀(yi)
┅┅一次性玻璃(li)試管(guan)
┅┅泵(beng)流操作架（包括空氣泵(beng)，不同(tong)容積(ji)的玻(bo)璃注射(she)器等）
┅┅燒(shao)杯(bei)，容量瓶(ping)，錐形(xing)瓶(ping)等
試劑：
┅┅甲醇（色譜級）
┅┅乙腈(jing)（色譜級）
┅┅石油(you)醚
┅┅蒸餾水(shui)或去離子(zi)水(shui)
┅┅氫(qing)氧化鈉(na)溶(rong)液（0.5mol/L）稱(cheng)取2g氫(qing)氧化鈉(na)溶(rong)解(jie)于100mL水中
【樣本處理步驟】
（一）牛奶
┅┅將100mL牛奶水浴(yu)加熱至40 oC；
┅┅4000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用
（二）乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品
┅┅稱取10g奶(nai)粉(fen)樣(yang)品，將100mL50 oC水(shui)多次少量加入(ru)，攪(jiao)拌，使奶(nai)粉(fen)充(chong)分(fen)溶(rong)解
┅┅6000r/min離心(xin)15min，收集50mL清澈液待(dai)用
（三）發酵乳(包括固體狀、半固體狀和帶果肉型)
┅┅稱取60 g混勻的試樣，用0.5 mol/L 的氫氧化鈉溶液在酸度計指示下調pH至7.4；
┅┅用高速均質器在 9500 轉(zhuan)/分鐘下告訴勻(yun)漿5 min
┅┅水浴加熱至40 oC；
┅┅4000r/min離心15min，收(shou)集50mL清(qing)澈液待用
（四）干酪
┅┅稱取經切細、過10目圓(yuan)孔篩(shai)混勻的試樣(yang)5g置于50 mL離心管(guan)中，加2 mL水和30 mL甲醇；
┅┅用高速均質器在(zai) 9500r/分鐘下告訴勻漿5 min；
┅┅超聲(sheng)提取30 min；
┅┅在6000r/分(fen)鐘(zhong)下離心15 min，收集上清液并移入250 mL分(fen)液漏斗(dou)中(zhong)。
┅┅在分(fen)液漏斗(dou)中(zhong)加(jia)入30 mL石(shi)油醚（4.3），振搖2 min；
┅┅待分層后(hou)，將(jiang)下層移于50 mL燒杯中(zhong)，棄去石油醚層。
┅┅重復用(yong)石油(you)醚提取2次(ci)；。
┅┅將下層(ceng)溶(rong)液移到(dao)100 mL圓底燒瓶中(zhong)，減壓(ya)濃縮(suo)至(zhi)約2 mL；┅┅濃縮(suo)液倒入(ru)離(li)心管中(zhong)，燒瓶用乙腈-水(shui)溶(rong)液(1+4) 5 mL分2次洗(xi)滌，洗(xi)滌液一并倒入(ru)50 mL離(li)心管中(zhong)；
┅┅加水稀釋至約50 mL，在6000 轉/分鐘下離心(xin) 5 min，上清液供(gong)凈化處理。
（五）奶油
┅┅稱取5g試樣，置于50 mL燒杯中；
┅┅用(yong)20 mL石油醚將(jiang)其溶解并移于(yu)250mL具塞錐(zhui)形瓶(ping)中。
┅┅加20 mL水和(he)30 mL甲醇(chun)，振(zhen)蕩30 min后，將(jiang)全(quan)部液(ye)(ye)體移于分液(ye)(ye)漏斗(dou)中；
┅┅待分層后(hou)，將下層溶(rong)液全部移到100 mL圓底(di)燒瓶中(zhong)，在旋轉蒸發儀中(zhong)減壓(ya)濃縮至約5 mL，加(jia)水稀釋至約50mL，供凈化處理。
【親和柱凈化步驟】
┅┅將免疫親和柱連接于(yu)10.0mL玻璃注(zhu)射(she)器(qi)下。準(zhun)確移(yi)取10.0mL清(qing)澈液注(zhu)入(ru)玻璃注(zhu)射(she)器(qi)；
┅┅將(jiang)空(kong)氣壓力(li)泵與玻璃注射(she)器連(lian)接，調節壓力(li)使溶液以約(yue)2-3mL/min流(liu)速緩慢通過免疫(yi)親和柱，直(zhi)至2~3mL空(kong)氣通過柱體；
┅┅在注射(she)器中加入10ml水，調節壓力(li)使水以(yi)約6mL/min流(liu)速清(qing)洗親和柱。
┅┅準確加入1mL色譜級乙腈洗(xi)(xi)脫(tuo)，流速(su)為1 mL/min ~2mL/min，收集全(quan)部洗(xi)(xi)脫(tuo)液于玻璃試管(guan)中，供檢(jian)測用。
【結果判定】
經免(mian)疫(yi)親和柱(zhu)凈化(hua)后，收集(ji)(ji)到的(de)乙(yi)腈洗脫液(ye)可直接使用(yong)熒光計或(huo)者(zhe)HPLC檢測，也可使用(yong)薄層色(se)譜或(huo)者(zhe)酶聯免(mian)疫(yi)試劑盒進行檢測。收集(ji)(ji)到的(de)1ml洗脫液(ye)中(zhong)的(de)黃曲(qu)霉毒素含量相當(dang)于10ml牛奶(nai)樣品(pin)、發酵(jiao)乳樣品(pin)或(huo)者(zhe)1g奶(nai)粉(fen)樣品(pin)、干(gan)酪樣品(pin)和奶(nai)油樣品(pin)中(zhong)黃曲(qu)霉毒素M1的(de)含量。
如(ru)果(guo)HPLC檢測需要其(qi)它溶劑，可以將(jiang)乙腈洗脫液氮氣吹干，然后復溶
【注意事項】
┅┅黃(huang)曲霉(mei)毒素危害極大，應戴手套操作。
┅┅使用過的玻璃容(rong)器(qi)及黃曲霉毒(du)素溶液(ye)最(zui)好用5%濃度的次氯(lv)酸鈉溶液(ye)浸(jin)泡過夜。
┅┅不要使用(yong)過了有效日期的免疫親和柱(zhu)。
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件：親和(he)柱(zhu)可(ke)(ke)于常溫保(bao)存(cun)(cun)(cun)，2-8℃儲存(cun)(cun)(cun)可(ke)(ke)延(yan)長有效(xiao)期，不可(ke)(ke)凍(dong)存(cun)(cun)(cun)。
保存期(qi)：該產品(pin)有效(xiao)期(qi)為12個月。
