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黃曲霉毒素B1 （Ⅰ型）ELISA檢測試劑盒說明書
【概要】
黃(huang)曲霉毒素是曲霉菌屬的(de)(de)黃(huang)曲霉和寄生(sheng)曲霉的(de)(de)二(er)次代謝產物(wu)，是自然(ran)界最(zui)危險的(de)(de)致癌(ai)物(wu)質(zhi)之(zhi)一，廣泛(fan)存在于谷(gu)物(wu)、堅(jian)果、棉籽以(yi)及以(yi)此為原(yuan)料生(sheng)產的(de)(de)各種食品、油料、酒類、飼料中，并(bing)能通過動物(wu)體(ti)產生(sheng)同樣有害(hai)的(de)(de)代謝產物(wu)，存在于牛奶及奶制品，肉(rou)類甚至人體(ti)血液，組(zu)織(zhi)中。
黃(huang)曲(qu)(qu)霉毒(du)素(su)中毒(du)性最強(qiang)的是黃(huang)曲(qu)(qu)霉毒(du)素(su)B1，是世(shi)界(jie)衛(wei)生(sheng)組織規(gui)定(ding)的I類致癌(ai)物質(zhi)，毒(du)性是砒霜的68倍，其幾乎一(yi)直和(he)黃(huang)曲(qu)(qu)霉毒(du)素(su)B2、G1 和(he) G2共存，是肝癌(ai)的三大致病(bing)因(yin)(yin)素(su)之首。世(shi)界(jie)大部分(fen)國家和(he)地區都已對食品(pin)和(he)飼料中的黃(huang)曲(qu)(qu)霉毒(du)素(su)最高允許水平(ping)作了規(gui)定(ding)，因(yin)(yin)此，準確測定(ding)食品(pin)及飼料中的黃(huang)曲(qu)(qu)霉毒(du)素(su)含(han)量(liang)對于食品(pin)安(an)全監控具有重(zhong)要意義。
【適用范圍】
可定性、定量(liang)檢測(ce)玉米(mi)、大米(mi)、麥類、豆(dou)類、花(hua)生、飼(si)料、食用油(you)等(deng)樣(yang)本中(zhong)的黃曲霉毒素B1。
【試驗原理】
本(ben)試劑(ji)盒采用(yong)競爭(zheng)ELISA原理，在(zai)微孔板上(shang)預(yu)包被(bei)(bei)黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素(su)(su)B1抗(kang)原，加入樣(yang)本(ben)/黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素(su)(su)B1標(biao)(biao)(biao)準品(pin)(pin)溶液及(ji)辣根(gen)過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)酶(mei)標(biao)(biao)(biao)記(ji)的(de)(de)(de)黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素(su)(su)B1抗(kang)體(ti)。樣(yang)本(ben)或標(biao)(biao)(biao)準品(pin)(pin)溶液中的(de)(de)(de)黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素(su)(su)B1與預(yu)包被(bei)(bei)在(zai)微孔板上(shang)的(de)(de)(de)黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素(su)(su)B1抗(kang)原競爭(zheng)結合(he)辣根(gen)過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)酶(mei)標(biao)(biao)(biao)記(ji)的(de)(de)(de)黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素(su)(su)B1抗(kang)體(ti)。未結合(he)的(de)(de)(de)酶(mei)標(biao)(biao)(biao)抗(kang)體(ti)在(zai)洗滌時(shi)被(bei)(bei)除去。再加入TMB顯色液，讀取吸光值(zhi)。樣(yang)本(ben)的(de)(de)(de)吸光值(zhi)與其所含(han)殘留(liu)(liu)物(wu)黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素(su)(su)B1的(de)(de)(de)含(han)量成(cheng)負相(xiang)關。對照標(biao)(biao)(biao)準曲(qu)(qu)(qu)(qu)(qu)線，即可得出相(xiang)應(ying)殘留(liu)(liu)物(wu)黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素(su)(su)B1的(de)(de)(de)含(han)量。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏(min)度：0.1ppb
【交叉反應率】
結構類似物 交叉反應率
黃曲霉毒素B1 …………………………………………………………… 100%
黃曲霉毒素B2 …………………………………………………………… 15%
黃曲霉毒素G1 …………………………………………………………… 11%
黃曲霉毒素(su)G2 …………………………………………………………… 4%
黃(huang)曲霉毒素(su)M1 …………………………………………………………… 0.5%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標(biao)準液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb
3. 酶標物1瓶 …………………………………………… 6ml
4. 顯色液1瓶 …………………………………………… 12ml
5. 終止液1瓶(ping) …………………………………………… 10ml
6. 濃縮洗滌(di)液 （10×）1瓶 …………………………50ml
7. 濃(nong)縮樣品稀(xi)釋(shi)液（10×）1瓶(ping) …………………… 50ml
【需要而未提供的設備及試劑】
設備：
┅┅微孔板(ban)酶(mei)標儀(yi)450nm/630nm
┅┅振蕩器
┅┅氮吹儀
┅┅粉(fen)碎機
┅┅離心(xin)機
┅┅天平(ping)：感(gan)量0.01g
┅┅微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl、八道移液器300μl
試劑：
┅┅甲醇(chun)（分析純）
┅┅石(shi)油(you)醚
┅┅去(qu)離子水（或蒸(zheng)餾水）
┅┅三(san)氯甲(jia)烷(wan)
┅┅NaCl
【試劑配制】
1. 樣品稀(xi)(xi)(xi)釋液(ye)(ye)(ye)：將濃縮(suo)(suo)樣品稀(xi)(xi)(xi)釋液(ye)(ye)(ye)用去離(li)子(zi)水按(an)1:9體積比進行稀(xi)(xi)(xi)釋（1份濃縮(suo)(suo)樣品稀(xi)(xi)(xi)釋液(ye)(ye)(ye)+9份去離(li)子(zi)水）。
2. 洗滌(di)工作液(ye)：將濃(nong)縮(suo)洗滌(di)液(ye)用去離(li)子水按(an)1:9體積比(bi)進行稀釋（1份濃(nong)縮(suo)洗滌(di)液(ye)+9份去離(li)子水）。
3. 谷物稀(xi)釋(shi)液(ye)：將(jiang)0.9gNaCl用配制(zhi)完成的(de)樣品稀(xi)釋(shi)液(ye)溶解并定容至100ml。
4. 啤(pi)酒稀釋(shi)(shi)液：取甲(jia)醇，用配制完成的(de)樣品(pin)稀釋(shi)(shi)液按(an)1:4體(ti)積比進行(xing)稀釋(shi)(shi)（1份(fen)甲(jia)醇+4份(fen)樣品(pin)稀釋(shi)(shi)液）。
5. 50%甲醇(chun)：取甲醇(chun)，用(yong)去離(li)子(zi)水按1:1體積比進行稀釋（1份無水甲醇(chun)+1份去離(li)子(zi)水）。
6. 80%甲醇：取甲醇，用去離(li)子水(shui)按4:1體積比進行(xing)稀(xi)釋（4份無水(shui)甲醇+1份去離(li)子水(shui)）。
【樣本前處理步驟】
一、 谷物（大米、玉米、小米等低脂含量）（稀釋倍數：8）
1. 取(qu)1.0g粉碎的樣(yang)品與8ml 谷(gu)物稀釋(shi)液混合均勻；
2. 強(qiang)力振蕩3min；
3. 5000g離心10min；
4. 取上(shang)清液100μl待測 。
二、 蛋糕（稀釋倍數：10）
1. 取(qu)1.0g粉(fen)碎的(de)樣品與4ml 50%甲(jia)醇(chun)混合均勻；
2. 強力振蕩(dang)3min；
3. 5000g離心(xin)10min；
4. 取(qu)400μl下層液體，加入600μl樣(yang)品稀(xi)釋液進行稀(xi)釋，充分(fen)混勻；
5. 取(qu)100μl稀釋后(hou)液(ye)體待(dai)測 。
三、 花生、奶油蛋糕（稀釋倍數：10）
1. 取1.0g粉碎的樣品與(yu)4.0ml石油醚(mi)混(hun)合均勻；
2. 加入4ml 50%甲醇混(hun)合均勻；
3. 強力振(zhen)蕩(dang)3min；
4. 5000g離心(xin)10min；
5. 取400μl下層液體，加入600μl樣品稀釋液進行稀釋，充(chong)分(fen)混勻；
6. 取100μl稀釋后液體待測(ce) 。
四、 食用油（稀釋倍數：10）
1. 取1.0g樣品(pin)與(yu)4.0ml石油醚混合均勻；
2. 加(jia)入4ml 50%甲(jia)醇混(hun)合，振蕩1min；
3. 靜置10min；
4. 取400μl下(xia)層液體，加入600μl樣品稀釋(shi)液進行稀釋(shi)，充分混勻(yun)；
5. 取100μl稀釋后液體待測 。
五、 飼料、面粉、湯圓（稀釋倍數：24）
1. 取3.0g粉碎的樣品與9.0ml 80%甲醇混(hun)合均勻；
2. 強力(li)振蕩(dang)3min；
3. 2000g離心10min；
4. 取上層清液(ye)100μl，加入700μl樣(yang)品(pin)稀(xi)釋液(ye)，混合均勻；
5. 取(qu)100μl稀(xi)釋后液(ye)體待測。
六、 啤酒（稀釋倍數：5）
1. 取(qu)200μl啤酒樣品（去除CO2），加入800μl啤酒稀釋(shi)液；
2. 振蕩3min；
3. 取100μl稀釋后液體待測。
七、醬油、醋、葡萄酒（稀釋倍數：8）
1. 取(qu)0.5ml樣品，加(jia)入0.5ml蒸餾水并加(jia)入4.0ml三氯甲(jia)烷；
2. 混勻振蕩(dang)3min，5000g離心(xin)10min；
3. 取1.0ml下層(ceng)液(ye)，60℃氮氣吹(chui)干；
4. 加入100μl乙腈溶解干燥(zao)物，并加入900μl樣品(pin)稀釋液，充分混勻(yun)；
5. 取100μl稀釋后液體待測。
【檢測步驟】
一、 測定前須知：
1. 使用之前(qian)將(jiang)所有試劑和所需(xu)板條回溫(wen)（20～25℃）。
2. 使用之(zhi)后立即(ji)將所(suo)有試劑及剩余板條(tiao)放置2～8℃，干(gan)燥環境保(bao)存有利(li)于保(bao)持試劑穩(wen)定性。
3. ELISA分析中的(de)再(zai)現(xian)性(xing)，很(hen)大(da)程度上取決于(yu)洗板的(de)一致性(xing)，正(zheng)確的(de)洗板操(cao)作是ELISA操(cao)作中的(de)要點(dian)。
4. 在所有恒溫孵育(yu)過程(cheng)中，避免光(guang)線照射，用(yong)蓋(gai)板膜(mo)封(feng)住微孔板。
二、操作步驟：
1. 將(jiang)所需試(shi)劑及微孔板取(qu)出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體(ti)試(shi)劑使(shi)用前均須搖勻。
2. 取(qu)出所需數量(liang)的(de)微孔(kong)板，將(jiang)不用的(de)微孔(kong)板與干燥劑一(yi)起(qi)重新真空密(mi)封，放置(zhi)于(yu)2～8℃。不可冷凍。
3. 洗滌工作液在使(shi)用前也需回溫。
4. 將(jiang)樣(yang)本(ben)和(he)標準(zhun)品對應(ying)微孔編號(hao)，每個樣(yang)本(ben)和(he)標準(zhun)品做2孔平行，并記錄標準(zhun)孔和(he)樣(yang)本(ben)孔所在的(de)位置。
5. 加標準品/樣本50μl到對應的微孔中，加入酶標物50μl/孔(kong)，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)振蕩混勻，用(yong)蓋(gai)板膜蓋(gai)板后置室溫避光反應15min。
6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔(kong)，洗板(ban)5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干(gan)。
7. 加入顯色液100μl/孔，輕(qing)輕(qing)振蕩(dang)混勻，用蓋(gai)板膜(mo)蓋(gai)板后置(zhi)室溫避光反應15min。
8. 加終止液50μl/孔，輕輕振(zhen)蕩混(hun)勻，設酶(mei)標儀于450nm處讀取每孔OD值。
【結果判定】
1. 百分吸光率的計算
標(biao)準品(pin)或樣(yang)本的(de)百(bai)分吸(xi)光(guang)率等于標(biao)準品(pin)或樣(yang)本的(de)百(bai)分吸(xi)光(guang)度值的(de)平(ping)均值（雙孔）除以第一個標(biao)準（0標(biao)準）的(de)吸(xi)光(guang)度值，再乘以100%，即(ji)
百分吸光率（%）＝ B/ B0×100%
B—標(biao)準溶(rong)液或(huo)樣本溶(rong)液的平均吸光度值
B0—0(ppb)標準溶液的平均吸光度值
2. 標準曲線的繪制與計算
以標(biao)(biao)(biao)準(zhun)品百(bai)分(fen)吸(xi)光率為縱坐標(biao)(biao)(biao)，黃曲(qu)(qu)霉毒素B1標(biao)(biao)(biao)準(zhun)品濃度（ppb）的(de)(de)對數(shu)為橫(heng)坐標(biao)(biao)(biao)，繪制標(biao)(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)(qu)線圖。將樣(yang)(yang)本(ben)的(de)(de)百(bai)分(fen)吸(xi)光率代入(ru)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)(qu)線中，從標(biao)(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)(qu)線上讀出樣(yang)(yang)本(ben)所(suo)對應的(de)(de)濃度，乘以其對應的(de)(de)稀釋倍(bei)數(shu)即(ji)為樣(yang)(yang)本(ben)中黃曲(qu)(qu)霉毒素B1實際含量。
【注意事項】
1. 室溫低(di)于20℃或試劑(ji)及樣本沒有(you)(you)恢復到室溫（20～25℃）會導致所有(you)(you)標準的OD值偏低(di)。
2. 在(zai)洗(xi)板過程中(zhong)如果(guo)出(chu)現板孔干燥的情況，則會(hui)出(chu)現標準曲(qu)線(xian)(xian)不成線(xian)(xian)性(xing)，重(zhong)復性(xing)不好(hao)的現象。所(suo)以(yi)洗(xi)板拍(pai)干后(hou)應立即進(jin)行(xing)下一步操作。
3. 每種試劑(ji)使用前(qian)均需搖勻。
4. 反應終止液為0.5M的硫酸，避免接(jie)觸皮膚。
5. 不(bu)(bu)要使(shi)(shi)用過(guo)了有(you)效期(qi)的試劑(ji)盒；也(ye)不(bu)(bu)要摻雜使(shi)(shi)用過(guo)了有(you)效期(qi)的試劑(ji)盒；不(bu)(bu)要交換使(shi)(shi)用不(bu)(bu)同批(pi)號(hao)試劑(ji)盒中(zhong)的試劑(ji)。
6. 儲存條件：
試劑(ji)盒保存于2～8℃，不能冷(leng)凍，將不用(yong)的(de)微孔板重(zhong)新(xin)真空密封。標準物質和無色的(de)顯(xian)色劑(ji)對(dui)光(guang)敏感，因此(ci)要(yao)避光(guang)保存。
7. 試(shi)劑變(bian)質的跡象：
顯(xian)色(se)試(shi)劑有任(ren)何顏色(se)表明顯(xian)色(se)劑變(bian)質，應當棄之。0標(biao)準(zhun)的吸光度（450/630nm）值(zhi)小(xiao)于0.5（A450nm<0.5）時，表示(shi)試(shi)劑可能變(bian)質。
8. 加入顯色液后(hou)，一般顯色時間(jian)(jian)為15～30min。若顏色較淺，可延(yan)長(chang)反應(ying)時間(jian)(jian)到35min（或更長(chang)），但不得超過40min。反之，則減(jian)短反應(ying)時間(jian)(jian)。
9. 該試劑(ji)盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測(ce)吸光度值和(he)靈敏(min)度發(fa)生變化。
【樣品最低檢測限】
谷物 …………………………………………………0.8ppb
蛋糕 ……………………………………………………1ppb
花生(sheng)、奶油蛋糕 ……………………………………1ppb
食用油 …………………………………………………1ppb
飼料、面粉(fen)、湯(tang)圓(yuan) ………………………………2.4ppb
啤酒 …………………………………………………0.5ppb
醬油、醋……………………………………………0.8ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件：保(bao)存試劑盒于2～8℃。
保存期：該(gai)產品有效期(qi)為12個月。
