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玉米赤霉烯酮(Ⅱ型)ELISA檢測試劑盒說明書
【概要】
玉(yu)米(mi)赤霉(mei)烯酮(Zearaleaone)又稱F-2毒素(su)，是(shi)玉(yu)米(mi)赤霉(mei)菌的(de)代謝產(chan)(chan)物，具有雌激(ji)素(su)樣作(zuo)用(yong)，具有較強的(de)生(sheng)(sheng)殖毒性和(he)致(zhi)畸作(zuo)用(yong)，可引起動(dong)物發生(sheng)(sheng)雌激(ji)素(su)亢進癥，導致(zhi)動(dong)物不(bu)孕或流產(chan)(chan)，對家禽、豬、牛和(he)羊的(de)影響較大(da)，給畜牧業帶來很大(da)的(de)經濟損失。
【適用范圍】
可(ke)定性、定量(liang)檢測(ce)谷類、飼料(liao)及(ji)其(qi)原料(liao)等(deng)樣(yang)本中(zhong)的玉米赤(chi)霉烯酮殘留量(liang)。
【試驗原理】
本試劑盒采(cai)用競爭ELISA，在微(wei)(wei)孔板上(shang)預(yu)包被(bei)玉(yu)米(mi)(mi)赤霉(mei)烯(xi)(xi)酮(tong)抗(kang)(kang)原(yuan)，加入(ru)樣(yang)本/玉(yu)米(mi)(mi)赤霉(mei)烯(xi)(xi)酮(tong)標(biao)準(zhun)品(pin)溶液(ye)及辣根過(guo)氧化物(wu)酶標(biao)記的玉(yu)米(mi)(mi)赤霉(mei)烯(xi)(xi)酮(tong)抗(kang)(kang)體(ti)。樣(yang)本或標(biao)準(zhun)品(pin)溶液(ye)中的玉(yu)米(mi)(mi)赤霉(mei)烯(xi)(xi)酮(tong)與(yu)預(yu)包被(bei)在微(wei)(wei)孔板上(shang)的玉(yu)米(mi)(mi)赤霉(mei)烯(xi)(xi)酮(tong)抗(kang)(kang)原(yuan)競爭結合(he)辣根過(guo)氧化物(wu)酶標(biao)記的玉(yu)米(mi)(mi)赤霉(mei)烯(xi)(xi)酮(tong)抗(kang)(kang)體(ti)。未結合(he)的酶標(biao)抗(kang)(kang)體(ti)在洗滌時被(bei)除去。再加入(ru)TMB顯(xian)色(se)，讀取吸(xi)光(guang)(guang)值。樣(yang)本的吸(xi)光(guang)(guang)值與(yu)其(qi)所含(han)殘(can)留(liu)物(wu)玉(yu)米(mi)(mi)赤霉(mei)烯(xi)(xi)酮(tong)抗(kang)(kang)原(yuan)的含(han)量成負相(xiang)關。對照標(biao)準(zhun)曲線，即可得出相(xiang)應殘(can)留(liu)物(wu)玉(yu)米(mi)(mi)赤霉(mei)烯(xi)(xi)酮(tong)的含(han)量。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒(he)靈敏度：20ppb
【交叉反應率】
結構類似物 交叉反應率
玉米赤霉烯酮 …………………………………………………………… 100%
α-玉(yu)米(mi)赤霉醇(chun) …………………………………………………………… 75%
β-玉(yu)米赤霉醇 …………………………………………………………… 61%
α-玉(yu)米(mi)赤霉烯醇 ………………………………………………………… 103%
β-玉米赤霉烯醇 …………………………………………………………… 83%
玉米赤(chi)霉(mei)酮 ………………………………………………………………… 75%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標(biao)準液(ye)×6瓶：（2ml/瓶）
0ppb, 20ppb, 40ppb, 80ppb, 240ppb, 720ppb
3. 酶標物 1瓶 ………………………………………… 7ml
4. 顯色液1瓶 ………………………………………… 12ml
5. 終止液1瓶 ………………………………………… 10ml
6. 濃縮(suo)洗滌液 （10×）1瓶(ping) ……………………… 50ml
7. 濃縮樣品稀釋液（10×） 1瓶………………… 20ml
【需要而未提供的設備及試劑】
設備：
┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm
┅┅振(zhen)蕩器
┅┅粉碎機
┅┅離心(xin)機(ji)
┅┅天平：感量0.01g
┅┅微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl、多道 300μl
試劑：
-----甲醇
----去離子水(shui)（或蒸餾水(shui)）
【試劑配制】
1. 樣品(pin)(pin)稀釋液：將濃(nong)縮樣品(pin)(pin)稀釋液用去離子水按1:9體積(ji)比(bi)進(jin)行稀釋（1份濃(nong)縮樣品(pin)(pin)稀釋液+9份去離子水）。
2. 洗(xi)滌(di)工作液：將濃(nong)縮洗(xi)滌(di)液用去(qu)離子(zi)水(shui)按(an)1:9體積比進(jin)行稀釋（1份濃(nong)縮洗(xi)滌(di)液+9份去(qu)離子(zi)水(shui)）。
3. 70％甲(jia)醇(chun)：取(qu)無水(shui)甲(jia)醇(chun)，用去離子水(shui)以7:3體積比(bi)例稀釋(shi)（7份無水(shui)甲(jia)醇(chun)＋3份水(shui)）
【樣本前處理步驟】
花生醬(jiang)、芝麻醬(jiang)、蛋(dan)黃醬(jiang)、面粉、餅干、蛋(dan)糕(gao)等(deng)食品，各種(zhong)飼料及花生粕(po)(po)、豆粕(po)(po)、麥麩、DDGS等(deng)原料（稀(xi)釋倍數(shu)：5）
1. 取(qu)10g粉碎的(de)樣(yang)品與50ml 70%甲醇水混合均(jun)勻（可根據提(ti)取(qu)容器(qi)，等比例適(shi)量(liang)調(diao)整）；
2. 高速均質2min或振蕩提(ti)取5min；
3. 2000g離(li)心5min或定性濾紙(zhi)過濾；
4. 取100μl上清液待測。
【檢測步驟】
一、 測定前須知：
1. 使用之(zhi)前將所有(you)試(shi)劑和所需板條回(hui)溫(wen)（20～25℃）。
2. 使(shi)用之后(hou)立即(ji)將(jiang)所有(you)試(shi)劑(ji)及剩余板條放(fang)置2～8℃，干(gan)燥環境保存有(you)利于保持(chi)試(shi)劑(ji)穩定(ding)性。
3. ELISA分(fen)析中的再現性，很大程度上(shang)取決于洗板(ban)的一致性，正確的洗板(ban)操作(zuo)是ELISA操作(zuo)中的要點(dian)。
4. 在所(suo)有恒(heng)溫孵育過程中，避免光線照射。用蓋板(ban)膜封(feng)住微(wei)孔(kong)板(ban)。
二、操作步驟：
1. 將(jiang)所需試劑(ji)及微孔板取(qu)出，放(fang)置室(shi)溫（20～25℃）30min以上，液體試劑(ji)使用前均須搖勻。
2. 取出所需數量的微(wei)(wei)孔板，將不用(yong)的微(wei)(wei)孔板與(yu)干燥(zao)劑(ji)一(yi)起重(zhong)新真空密封，放置(zhi)于(yu)2～8℃。不可(ke)冷凍(dong)。
3. 洗滌(di)工(gong)作(zuo)液(ye)在使(shi)用前也需(xu)回溫。
4. 將樣(yang)本和標準(zhun)(zhun)品對應微孔(kong)編號，每個樣(yang)本和標準(zhun)(zhun)品做2孔(kong)平行，并記錄標準(zhun)(zhun)孔(kong)和樣(yang)本孔(kong)所在(zai)的位置。
5. 每孔中加入60μl樣品稀釋液。
6. 加標準品/樣本30μl到對應的微孔中，加入酶標物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用(yong)蓋板膜蓋板后置室(shi)溫避光反(fan)應15min。
7. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次(ci)，每次(ci)間隔30s，用吸水(shui)紙(zhi)拍干。
8. 加入顯色液100μl/孔，輕(qing)輕(qing)振(zhen)蕩混(hun)勻，用(yong)蓋(gai)板膜蓋(gai)板后置室溫避光(guang)反應15min。
9. 加終止液50μl/孔(kong)，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)振蕩混勻(yun)，設酶標儀于450nm處(chu)讀取(qu)每(mei)孔(kong)OD值。
【結果判定】
1. 百分吸光率的計算
標(biao)(biao)準品或(huo)(huo)樣(yang)本(ben)的(de)(de)百(bai)分(fen)吸(xi)光率等(deng)于(yu)標(biao)(biao)準品或(huo)(huo)樣(yang)本(ben)的(de)(de)百(bai)分(fen)吸(xi)光度值(zhi)的(de)(de)平均值(zhi)（雙(shuang)孔(kong)）除以第一個(ge)標(biao)(biao)準（0標(biao)(biao)準）的(de)(de)吸(xi)光度值(zhi)，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—標(biao)準溶液(ye)或(huo)樣本溶液(ye)的平均吸光(guang)度值
B0—0(ppb)標準(zhun)溶液的平均(jun)吸光(guang)度值
2. 標準曲線的繪制與計算
以(yi)標(biao)準(zhun)(zhun)品百分(fen)吸(xi)光率為縱坐標(biao)，玉米(mi)赤霉(mei)烯(xi)酮(tong)標(biao)準(zhun)(zhun)品濃(nong)度(du)（ppb）的(de)對(dui)數為橫(heng)坐標(biao)，繪(hui)制標(biao)準(zhun)(zhun)曲(qu)線圖(tu)。將樣(yang)本(ben)的(de)百分(fen)吸(xi)光率代(dai)入(ru)標(biao)準(zhun)(zhun)曲(qu)線中，從標(biao)準(zhun)(zhun)曲(qu)線上讀出樣(yang)本(ben)所(suo)對(dui)應的(de)濃(nong)度(du)，乘(cheng)以(yi)其(qi)對(dui)應的(de)稀釋倍(bei)數即(ji)為樣(yang)本(ben)中玉米(mi)赤霉(mei)烯(xi)酮(tong)實際含量。
【注意事項】
1. 室溫低(di)于20℃或(huo)試劑及樣本沒有恢(hui)復到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低(di)。
2. 在洗板過程中如果出現(xian)板孔(kong)干燥(zao)的情(qing)況(kuang)，則會出現(xian)標(biao)準曲線(xian)(xian)不成(cheng)線(xian)(xian)性，重復性不好的現(xian)象(xiang)。所以洗板拍干后(hou)應立(li)即進行下一步操作。
3. 每種試劑使用前均需搖勻。
4. 反應(ying)終止液為0.5M硫(liu)酸(suan)，避(bi)免接觸皮膚(fu)。
5. 不要(yao)使用過(guo)了有效期的(de)試(shi)劑(ji)盒(he)；也不要(yao)摻雜使用過(guo)了有效期的(de)試(shi)劑(ji)盒(he)；不要(yao)交換使用不同(tong)批號試(shi)劑(ji)盒(he)中(zhong)的(de)試(shi)劑(ji)。
6. 儲存(cun)條件：
試劑盒(he)保(bao)存(cun)于2～8℃，不能(neng)冷凍(dong)，將(jiang)不用的微孔板重新(xin)真空密封。標準(zhun)物質和無色(se)的顯色(se)劑對(dui)光(guang)敏感，因此要避光(guang)保(bao)存(cun)。
7. 試(shi)劑變質的跡(ji)象：
顯色試劑(ji)有任何顏色表明(ming)顯色劑(ji)變質(zhi)，應當(dang)棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小于(yu)0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑(ji)可(ke)能變質(zhi)。
8. 加入顯色液后，一(yi)般顯色時(shi)間為15～30min。若(ruo)顏色較淺，可延長反(fan)(fan)應時(shi)間到35min（或更長），但(dan)不得超過40min。反(fan)(fan)之，則減(jian)短反(fan)(fan)應時(shi)間。
9. 該試(shi)劑盒(he)最佳反(fan)應溫(wen)度(du)為25℃，溫(wen)度(du)過高(gao)或過低將導致檢測吸光度(du)值和靈敏度(du)發(fa)生變(bian)化。
【樣品最低檢測限】
飼料………………………………………………200ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏(zang)條(tiao)件：保存試劑(ji)盒(he)于2～8℃。
保(bao)存期：該產品有效期為12個月。
