赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）ELISA檢測試劑盒說明書
【概要】
赭(zhe)曲霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)(du)(du)素(su)(su)A （Ochratoxin A）是(shi)曲霉(mei)(mei)屬(shu)和(he)青霉(mei)(mei)屬(shu)的(de)真菌形(xing)成(cheng)的(de)次級代謝(xie)產(chan)物(wu)，屬(shu)烈性的(de)腎(shen)臟毒(du)(du)(du)(du)(du)和(he)肝臟毒(du)(du)(du)(du)(du)，廣泛存(cun)在于各種食(shi)物(wu)中。谷物(wu)及其副產(chan)品是(shi)赭(zhe)曲霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)(du)(du)素(su)(su)A的(de)主(zhu)要來源。動物(wu)實驗表明攝(she)入了被這(zhe)種毒(du)(du)(du)(du)(du)素(su)(su)污染的(de)飼料(liao)后(hou)，會發生急性或慢性中毒(du)(du)(du)(du)(du)癥。防止(zhi)污染赭(zhe)曲霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)(du)(du)素(su)(su)A的(de)食(shi)品和(he)飼料(liao)直接或間接地進入人類食(shi)物(wu)鏈(lian)，加(jia)強對赭(zhe)曲霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)(du)(du)素(su)(su)A的(de)檢測十分重要。
【適用范圍】
可(ke)定性(xing)、定量檢測谷物(wu)、飼料、面粉、啤酒(jiu)、紅酒(jiu)、飲料等(deng)樣本中的赭曲(qu)霉毒素(su)A。
【試驗原理】
本(ben)試劑盒采(cai)用競爭ELISA，在(zai)微孔(kong)板上(shang)預包(bao)(bao)被赭(zhe)(zhe)(zhe)曲(qu)霉毒(du)(du)(du)素A抗(kang)原，加(jia)入樣本(ben)/赭(zhe)(zhe)(zhe)曲(qu)霉毒(du)(du)(du)素A標(biao)準品溶(rong)液(ye)及辣(la)根(gen)過氧(yang)化物(wu)酶標(biao)記(ji)的(de)(de)赭(zhe)(zhe)(zhe)曲(qu)霉毒(du)(du)(du)素A抗(kang)體。樣本(ben)或標(biao)準品溶(rong)液(ye)中(zhong)的(de)(de)赭(zhe)(zhe)(zhe)曲(qu)霉毒(du)(du)(du)素A與(yu)預包(bao)(bao)被在(zai)微孔(kong)板上(shang)的(de)(de)赭(zhe)(zhe)(zhe)曲(qu)霉毒(du)(du)(du)素A抗(kang)原競爭結合辣(la)根(gen)過氧(yang)化物(wu)酶標(biao)記(ji)的(de)(de)赭(zhe)(zhe)(zhe)曲(qu)霉毒(du)(du)(du)素A抗(kang)體。未結合的(de)(de)酶標(biao)抗(kang)體在(zai)洗(xi)滌時被除去(qu)，再加(jia)入顯(xian)色液(ye)，讀取吸光值。樣本(ben)的(de)(de)吸光值與(yu)其所含殘(can)留物(wu)赭(zhe)(zhe)(zhe)曲(qu)霉毒(du)(du)(du)素A抗(kang)原的(de)(de)含量成負相關。對照標(biao)準曲(qu)線，即可(ke)得出(chu)相應殘(can)留物(wu)赭(zhe)(zhe)(zhe)曲(qu)霉毒(du)(du)(du)素A的(de)(de)含量。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈(ling)敏度：1ppb
【交叉反應率】
結構類似物 交叉反應率
赭曲(qu)霉毒(du)素(su)A …………………………………………………………… 100%
赭曲(qu)霉毒素B …………………………………………………………… ; 43%
赭曲(qu)霉(mei)毒素C …………………………………………………………… 5%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標準(zhun)液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppb, 1ppb, 3ppb, 9ppb, 18ppb, 54ppb
3. 酶標物 1瓶 …………………………………… 7ml
4. 顯色(se)液1瓶 …………………………………… 12ml
5. 終止(zhi)液1瓶 …………………………………… 10ml
6. 濃縮(suo)洗滌(di)液（10×）1瓶 …………………… 50ml
7. 濃縮樣品稀釋液（10×）1瓶……………… 20ml
【需要而未提供的設備及試劑】
設備：
---微孔(kong)板酶標儀450nm
---振(zhen)蕩器
---粉碎機
---離心(xin)機(ji)
---微(wei)量天平(ping)
---微(wei)量移液器：單(dan)道 20μl～200μl、200μl～1000μl、多道 300μl
試劑：
---去離子水（或蒸餾水）
---二(er)氯甲烷
---鹽酸
---NaHCO3
【試劑配制】
1. 樣品稀(xi)釋(shi)液(ye)(ye)：將濃(nong)縮樣品稀(xi)釋(shi)液(ye)(ye)用去離子水(shui)按1:9體積比進(jin)行稀(xi)釋(shi)（1份濃(nong)縮樣品稀(xi)釋(shi)液(ye)(ye)+9份去離子水(shui)）。
2. 洗(xi)滌工(gong)作液(ye)：將濃(nong)縮洗(xi)滌液(ye)用去(qu)離子(zi)水(shui)按(an)1:9體積比進行稀釋(shi)（1份濃(nong)縮洗(xi)滌液(ye)+9份去(qu)離子(zi)水(shui)）。
【樣品前處理步驟】
一、谷物與飼料（稀釋倍數：2.5）
1. 稱取1g粉碎(sui)的樣品，加入0.5ml 0.13M NaHCO3，震蕩1min，
2. 加入2ml樣品(pin)稀釋液(ye)，震蕩5min；
3. 室溫下(xia)，2000g離心15min；
4. 取100μl待測。
二、果汁、啤酒、飲料（稀釋倍數：1）
1. 碳酸(suan)飲料應去(qu)(qu)除CO2（60℃水浴或(huo)振(zhen)蕩去(qu)(qu)除）
2. 取2ml 樣品，加入(ru) 1ml 1mol/L HCl 振勻(yun)，加入(ru)2ml CH2Cl2 振勻(yun) 3min；
3. 室溫(wen)下，3500g離心10min；
4. 去除上層液，吸(xi)取下層1ml,加入800μl樣品(pin)稀釋液，強烈振(zhen)蕩3min；
5. 室溫下，3500g離心(xin)10min；
6. 取480μl上層液，加入120μl甲(jia)醇，振蕩(dang)均(jun)勻，取100μl待(dai)測。
【檢測步驟】
一、 測定前須知：
1. 使用之前(qian)將(jiang)所有試劑和所需板條(tiao)回溫（20～25℃）。
2. 使(shi)用之后立(li)即將所有試(shi)劑及剩余板(ban)條放置2～8℃，干燥環(huan)境保(bao)(bao)存有利(li)于保(bao)(bao)持試(shi)劑穩定性。。
3. ELISA分析中(zhong)的再(zai)現性(xing)，很(hen)大(da)程度(du)上(shang)取決于(yu)洗(xi)板的一致性(xing)，正(zheng)確的洗(xi)板操(cao)作(zuo)是(shi)ELISA操(cao)作(zuo)中(zhong)的要點。
4. 在所(suo)有(you)恒溫孵育過程中，避免光線照射(she)，用蓋(gai)板膜封住(zhu)微孔板。
二、操作步驟：
1. 將所需試劑及微孔板取(qu)出，放置室溫（20～25℃）30min以(yi)上，液體(ti)試劑使用前均須搖勻。
2. 取出所需數量的(de)微孔板，將不(bu)用的(de)微孔板與(yu)干(gan)燥(zao)劑一起(qi)重新真空密(mi)封，放置于2～8℃。不(bu)可冷(leng)凍。
3. 洗滌工(gong)作液在使(shi)用前也需回溫。
4. 將樣本(ben)和(he)標準品對應微孔(kong)編號，每個樣本(ben)和(he)標準品做2孔(kong)平行(xing)，并記錄標準孔(kong)和(he)樣本(ben)孔(kong)所在(zai)的(de)位置(zhi)。
5. 加標準品/樣本50μl到對應的微孔中，加入酶標物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋(gai)板(ban)膜蓋(gai)板(ban)后置室(shi)溫避光反應15min。
6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干。
7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混(hun)勻，用蓋板(ban)膜蓋板(ban)后置室(shi)溫避光反(fan)應(ying)15min。
8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設酶(mei)標儀于450nm處讀取每孔OD值。
【結果判定】
1. 百(bai)分吸(xi)光率的計算
標(biao)準品或樣本(ben)(ben)的百分吸光率等于標(biao)準品或樣本(ben)(ben)的百分吸光度(du)值的平均值（雙孔(kong)）除(chu)以(yi)第一個標(biao)準（0標(biao)準）的吸光度(du)值，再(zai)乘(cheng)以(yi)100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)標準溶液(ye)的平均吸光度值
2. 標準曲線的繪制與計算
以(yi)標(biao)(biao)準(zhun)品百分(fen)吸光率(lv)為(wei)(wei)縱坐(zuo)標(biao)(biao)，赭(zhe)曲(qu)霉毒素(su)A標(biao)(biao)準(zhun)品濃度（ppb）的對數(shu)為(wei)(wei)橫(heng)坐(zuo)標(biao)(biao)，繪制標(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)圖。將樣本(ben)(ben)的百分(fen)吸光率(lv)代入標(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)中(zhong)，從標(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)上讀出樣本(ben)(ben)所對應(ying)的濃度，乘以(yi)其對應(ying)的稀釋倍數(shu)即為(wei)(wei)樣本(ben)(ben)中(zhong)赭(zhe)曲(qu)霉毒素(su)A實際量。
【注意事項】
1. 室溫(wen)低于20℃或試劑及樣本沒有恢復到(dao)室溫(wen)（20～25℃）會導致所(suo)有標(biao)準的OD值偏低。
2. 在洗(xi)板(ban)過(guo)程中如果出現(xian)板(ban)孔干燥(zao)的情況，則會出現(xian)標準曲線不成(cheng)線性(xing)，重(zhong)復性(xing)不好的現(xian)象。所以洗(xi)板(ban)拍干后(hou)應立即進(jin)行下一(yi)步操(cao)作。
3. 每種(zhong)試劑使用前均(jun)需搖勻。
4. 反應(ying)終止(zhi)液為0.5M硫酸(suan)，避免接觸(chu)皮(pi)膚。
5. 不要(yao)使(shi)用過了有(you)效期的試劑(ji)盒；也不要(yao)摻(chan)雜使(shi)用過了有(you)效期的試劑(ji)盒；不要(yao)交換使(shi)用不同批(pi)號試劑(ji)盒中的試劑(ji)。
6. 儲存條件：
試劑盒保(bao)(bao)存于2～8℃，不(bu)能冷凍(dong)，將不(bu)用的(de)微孔板重新真(zhen)空(kong)密封。標準(zhun)物質和無色(se)的(de)顯色(se)劑對光敏感，因此要避光保(bao)(bao)存。
7. 試劑變質(zhi)的跡象(xiang)：
顯色試劑(ji)有任何顏色表(biao)明顯色劑(ji)變質(zhi)(zhi)，應當(dang)棄之。0標(biao)準(zhun)的(de)吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時，表(biao)示試劑(ji)可能變質(zhi)(zhi)。
8. 加入顯色(se)液后，一(yi)般顯色(se)時間(jian)(jian)為(wei)15～30min。若顏色(se)較淺(qian)，可延長(chang)反(fan)應(ying)時間(jian)(jian)到35min（或更長(chang)），但不得超(chao)過40min。反(fan)之，則減(jian)短反(fan)應(ying)時間(jian)(jian)。
9. 該試劑盒(he)最佳(jia)反應溫(wen)度為25℃，溫(wen)度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏(min)度發生變化。
【樣品最低檢測限】
谷物、飼料 …………………………………………… 2.5ppb
果汁(zhi)、啤酒、飲料 …………………………………… 1ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件：保(bao)存試劑盒于2～8℃。
保存期：該產品有效期(qi)為12個(ge)月。
