|
|
 |
 |
玉米赤霉烯酮(Ⅰ型)ELISA檢測試劑盒說明書
【概要】
玉米(mi)赤霉烯酮(Zearaleaone)又(you)稱F-2毒(du)素，是玉米(mi)赤霉菌(jun)的代謝(xie)產物，具有(you)雌激(ji)素樣作用，具有(you)較強的生(sheng)殖毒(du)性和致(zhi)畸作用，可(ke)引(yin)起動物發生(sheng)雌激(ji)素亢進(jin)癥，導致(zhi)動物不孕或流產，對家禽、豬、牛(niu)和羊(yang)的影響較大，給畜(chu)牧(mu)業帶來(lai)很(hen)大的經(jing)濟損失。
【適用范圍】
可定性、定量檢測谷類、啤酒(jiu)及飼料等樣(yang)本中的玉米(mi)赤霉烯(xi)酮殘留(liu)量。
【試驗原理】
本(ben)試劑盒采用競爭ELISA，在(zai)微孔板(ban)上(shang)預包被(bei)玉(yu)米(mi)(mi)赤(chi)霉(mei)(mei)烯酮(tong)(tong)(tong)(tong)抗(kang)原(yuan)，加入(ru)樣本(ben)/玉(yu)米(mi)(mi)赤(chi)霉(mei)(mei)烯酮(tong)(tong)(tong)(tong)標準品溶液及辣(la)(la)根(gen)過氧化(hua)物酶(mei)標記的(de)玉(yu)米(mi)(mi)赤(chi)霉(mei)(mei)烯酮(tong)(tong)(tong)(tong)抗(kang)體。樣本(ben)或標準品溶液中的(de)玉(yu)米(mi)(mi)赤(chi)霉(mei)(mei)烯酮(tong)(tong)(tong)(tong)與(yu)預包被(bei)在(zai)微孔板(ban)上(shang)的(de)玉(yu)米(mi)(mi)赤(chi)霉(mei)(mei)烯酮(tong)(tong)(tong)(tong)抗(kang)原(yuan)競爭結(jie)合辣(la)(la)根(gen)過氧化(hua)物酶(mei)標記的(de)玉(yu)米(mi)(mi)赤(chi)霉(mei)(mei)烯酮(tong)(tong)(tong)(tong)抗(kang)體。未結(jie)合的(de)酶(mei)標抗(kang)體在(zai)洗滌時被(bei)除去。再加入(ru)TMB顯色，讀取吸光值。樣本(ben)的(de)吸光值與(yu)其所含殘(can)留(liu)物玉(yu)米(mi)(mi)赤(chi)霉(mei)(mei)烯酮(tong)(tong)(tong)(tong)抗(kang)原(yuan)的(de)含量成負相(xiang)關。對照(zhao)標準曲(qu)線，即可得出相(xiang)應殘(can)留(liu)物玉(yu)米(mi)(mi)赤(chi)霉(mei)(mei)烯酮(tong)(tong)(tong)(tong)的(de)含量。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏度：0.2ppb
【交叉反應率】
結構類似物 交叉反應率
玉(yu)米赤霉烯酮 …………………………………………………………… 100%
α-玉米赤霉醇 …………………………………………………………… 75%
β-玉米(mi)赤霉醇(chun) …………………………………………………………… 61%
α-玉米赤(chi)霉烯醇 ………………………………………………………… 103%
β-玉(yu)米(mi)赤霉烯醇 …………………………………………………………… 83%
玉米(mi)赤霉酮 ………………………………………………………………… 75%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊(kuai)
2. 標準(zhun)液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppb, 0.2ppb, 0.6ppb, 1.8ppb, 5.4ppb, 16.2ppb
3. 酶(mei)標(biao)物 1瓶 ………………………………………… 7ml
4. 顯色液1瓶 ………………………………………… 12ml
5. 終止液1瓶 ………………………………………… 10ml
6. 濃縮洗滌液 （10×）1瓶 ……………………… 50ml
7. 濃縮樣品(pin)稀(xi)釋液(ye)（10×） 1瓶(ping)………………… 20ml
【需要而未提供的設備及試劑】
設備：
┅┅微孔板(ban)酶標儀450nm/630nm
┅┅振蕩(dang)器
┅┅粉碎機
┅┅離心機
┅┅天平：感量0.01g
┅┅微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl、多道 300μl
試劑：
-----甲(jia)醇
----去離(li)子水（或(huo)蒸餾水）
【試劑配制】
1. 樣品(pin)稀(xi)釋液(ye)(ye)：將(jiang)濃縮樣品(pin)稀(xi)釋液(ye)(ye)用(yong)去離子(zi)水按1:9體積比(bi)進行(xing)稀(xi)釋（1份濃縮樣品(pin)稀(xi)釋液(ye)(ye)+9份去離子(zi)水）。
2. 洗滌工作液：將濃縮(suo)(suo)洗滌液用去(qu)離子水(shui)按1:9體積比進(jin)行稀釋（1份(fen)濃縮(suo)(suo)洗滌液+9份(fen)去(qu)離子水(shui)）。
3. 50％甲醇(chun)：取(qu)無(wu)水甲醇(chun)，用(yong)去離子(zi)水以1:1體積(ji)比例稀釋（1份無(wu)水甲醇(chun)＋1份水）。
4. 40％甲醇(chun)(chun)(chun)：取無(wu)水(shui)(shui)甲醇(chun)(chun)(chun)，用去離子水(shui)(shui)以(yi)4:6體積比例稀釋（4份無(wu)水(shui)(shui)甲醇(chun)(chun)(chun)＋6份水(shui)(shui)）。
【樣本前處理步驟】
一、 谷物（稀釋倍數：10）
1. 取1g粉碎樣品，加入4ml 50％甲醇；
2. 劇(ju)烈振蕩5min；
3. 4000g離心5min；
4. 取上清液400μl，加入600μl樣本稀釋液，混(hun)勻(yun)；
5. 取稀釋后液體(ti)待測。
二、啤酒（稀釋倍數：10）
1. 取待測啤酒(jiu)，除凈氣體（60℃水浴或(huo)振(zhen)蕩去除）；
2. 取1ml啤酒，加入4ml40%甲醇；
3. 劇(ju)烈振蕩5min；
4. 取(qu)上述液體500μl，加入樣本(ben)稀釋液500μl，混勻；
5. 取(qu)稀釋后液體待測。
三、飼料（稀釋倍數：200）
1. 取(qu)0.5g粉碎樣本，加入20ml無水甲醇；
2. 充分振蕩5min；
3. 5000rpm離心5min；
4. 取(qu)上清液(ye)100μl加入樣本稀(xi)釋(shi)液(ye)400μl混勻；
5. 取稀釋后液體待(dai)測。
【檢測步驟】
一、 測定前須知：
1. 使用之前將所有試(shi)劑(ji)和所需(xu)板條回(hui)溫（20～25℃）。
2. 使用之后立(li)即將所(suo)有(you)試劑及剩余(yu)板(ban)條放(fang)置2～8℃，干燥(zao)環境保存有(you)利于保持(chi)試劑穩定性。
3. ELISA分析中的再(zai)現性，很大程度上(shang)取決于洗板的一致性，正確的洗板操(cao)作是(shi)ELISA操(cao)作中的要(yao)點(dian)。
4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線(xian)照射，用蓋板膜封住微(wei)孔板。
二、操作步驟：
1. 將所(suo)需(xu)試劑(ji)及微孔(kong)板取出，放置室(shi)溫（20～25℃）30min以上(shang)，液(ye)體試劑(ji)使(shi)用(yong)前(qian)均須搖勻(yun)。
2. 取出所需(xu)數量的(de)微孔板(ban)，將不用的(de)微孔板(ban)與干燥(zao)劑一起重新真空密(mi)封，放置于2～8℃。不可冷凍。
3. 洗滌(di)工作液在使用前也(ye)需回溫。
4. 將樣(yang)本(ben)(ben)和(he)標準(zhun)(zhun)品(pin)對應(ying)微孔(kong)編號，每個樣(yang)本(ben)(ben)和(he)標準(zhun)(zhun)品(pin)做2孔(kong)平行，并記(ji)錄標準(zhun)(zhun)孔(kong)和(he)樣(yang)本(ben)(ben)孔(kong)所(suo)在的(de)位置。
5. 加標準品/樣本50μl到對應的微孔中，加入酶標物50μl/孔(kong)，輕(qing)輕(qing)振蕩混勻，用蓋(gai)板膜蓋(gai)板后(hou)置(zhi)室溫避光反應(ying)15min。
6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間(jian)隔30s，用吸水(shui)紙拍干。
7. 加入顯色液100μl/孔，輕(qing)輕(qing)振(zhen)蕩(dang)混勻，用蓋板膜蓋板后(hou)置室溫避光反應15min。
8. 加終止液50μl/孔(kong)，輕輕振蕩混勻，設(she)酶標儀于450nm處讀取每孔(kong)OD值。
【結果判定】
1. 百分吸光率的計算
標準品(pin)或(huo)樣本的(de)百分吸(xi)光(guang)率(lv)等于標準品(pin)或(huo)樣本的(de)百分吸(xi)光(guang)度(du)值的(de)平均值（雙(shuang)孔(kong)）除以(yi)第(di)一個標準（0標準）的(de)吸(xi)光(guang)度(du)值，再乘以(yi)100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度(du)值
B0—0(ppb)標(biao)準(zhun)溶(rong)液(ye)的(de)平均(jun)吸(xi)光(guang)度值(zhi)
2. 標準曲線的繪制與計算
以標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)百分(fen)吸(xi)光率(lv)為(wei)縱坐(zuo)標(biao)(biao)，玉米赤(chi)霉烯酮標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)濃(nong)(nong)度(du)（ppb）的(de)(de)(de)對數為(wei)橫坐(zuo)標(biao)(biao)，繪制標(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)(qu)線圖(tu)。將樣本(ben)的(de)(de)(de)百分(fen)吸(xi)光率(lv)代入標(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)(qu)線中，從標(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)(qu)線上讀出(chu)樣本(ben)所對應的(de)(de)(de)濃(nong)(nong)度(du)，乘以其對應的(de)(de)(de)稀釋
