|
|
 |
 |
黃曲霉毒素B1（Ⅱ型）ELISA檢測試劑盒說明書
【概要】
黃曲霉(mei)(mei)(mei)毒素是(shi)曲霉(mei)(mei)(mei)菌屬的(de)(de)黃曲霉(mei)(mei)(mei)和寄生曲霉(mei)(mei)(mei)的(de)(de)二次代(dai)謝產(chan)物(wu)，是(shi)自然(ran)界(jie)最危(wei)險的(de)(de)致癌物(wu)質(zhi)之(zhi)一，廣泛存在于谷物(wu)、堅果、棉籽以及以此為原料(liao)生產(chan)的(de)(de)各種食品、油料(liao)、酒(jiu)類(lei)、飼料(liao)中(zhong)，并能通過(guo)動物(wu)體產(chan)生同樣(yang)有(you)害的(de)(de)代(dai)謝產(chan)物(wu)，存在于牛奶及奶制品，肉類(lei)甚至人體血液，組織(zhi)中(zhong)。
黃(huang)(huang)曲(qu)霉(mei)毒(du)素中(zhong)毒(du)性最強的是(shi)黃(huang)(huang)曲(qu)霉(mei)毒(du)素B1，是(shi)世界(jie)(jie)衛生組(zu)織規定(ding)的I類致癌物質，毒(du)性是(shi)砒(pi)霜的68倍，其幾乎一直(zhi)和黃(huang)(huang)曲(qu)霉(mei)毒(du)素B2、G1 和 G2共(gong)存，是(shi)肝癌的三大致病(bing)因素之首。世界(jie)(jie)大部分國家和地區都已對食(shi)品和飼料中(zhong)的黃(huang)(huang)曲(qu)霉(mei)毒(du)素最高允(yun)許水平作了規定(ding)，因此，準(zhun)確(que)測定(ding)食(shi)品及飼料中(zhong)的黃(huang)(huang)曲(qu)霉(mei)毒(du)素含量對于食(shi)品安全監控(kong)具有重要意(yi)義。
【適用范圍】
可定(ding)性、定(ding)量檢測(ce)玉米、大米、麥類(lei)、豆類(lei)、花生、飼料等樣本(ben)中(zhong)的黃曲霉毒素B1。
【試驗原理】
本(ben)試劑盒采用競爭ELISA原(yuan)理，在(zai)微(wei)孔(kong)板上預(yu)包(bao)被黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素B1抗(kang)原(yuan)，加入樣(yang)本(ben)/黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素B1標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)溶(rong)液(ye)及(ji)辣(la)根過(guo)氧化物(wu)酶(mei)標(biao)(biao)記(ji)的(de)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素B1抗(kang)體。樣(yang)本(ben)或標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)溶(rong)液(ye)中的(de)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素B1與(yu)預(yu)包(bao)被在(zai)微(wei)孔(kong)板上的(de)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素B1抗(kang)原(yuan)競爭結(jie)合辣(la)根過(guo)氧化物(wu)酶(mei)標(biao)(biao)記(ji)的(de)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素B1抗(kang)體。未結(jie)合的(de)酶(mei)標(biao)(biao)抗(kang)體在(zai)洗(xi)滌時(shi)被除去(qu)。再加入TMB顯色液(ye)，讀取吸光(guang)值。樣(yang)本(ben)的(de)吸光(guang)值與(yu)其所含(han)殘留物(wu)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素B1的(de)含(han)量成(cheng)負相(xiang)(xiang)關。對照標(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)(qu)線，即(ji)可得出相(xiang)(xiang)應殘留物(wu)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素B1的(de)含(han)量。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈(ling)敏度：0.5ppb
【交叉反應率】
結構類似物 交叉反應率
黃曲霉毒素B1 …………………………………………………………… 100%
黃曲霉毒素B2 …………………………………………………………… 15%
黃(huang)曲霉毒(du)素G1 …………………………………………………………… 11%
黃曲霉毒(du)素G2 …………………………………………………………… 4%
黃(huang)曲霉毒素M1 …………………………………………………………… 0.5%
【試劑盒組成】
1. 96孔板(ban)×1塊
2. 標準(zhun)液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppb, 0.5ppb, 2ppb, 4ppb, 8ppb,16ppb
3. 酶標物1瓶 ……………………………………………6ml
4. 顯色液(ye)1瓶 …………………………………………12ml
5. 終止液1瓶 …………………………………………10ml
6. 濃(nong)縮洗滌(di)液 （10×）1瓶………………………… 50ml
7. 濃縮樣品稀(xi)釋(shi)液（10×）1瓶 ……………………50ml
【需要而未提供的設備及試劑】
設備：
┅┅微孔(kong)板(ban)酶(mei)標儀(yi)450nm/630nm
┅┅振(zhen)蕩器（可選(xuan)）
┅┅粉碎(sui)機
┅┅離(li)心(xin)機（可選）
┅┅天平：感量(liang)0.01g
┅┅微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl、八道300μl
試劑：
┅┅甲醇（分析純）
┅┅去離子水（或(huo)蒸餾水）
【試劑配制】
1. 樣品稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)：將濃縮樣品稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)用(yong)去離子水按1:9體積比進(jin)行稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)（1份濃縮樣品稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)+9份去離子水）。
2. 洗(xi)(xi)滌(di)工作液(ye)：將濃縮洗(xi)(xi)滌(di)液(ye)用去離子水按1:9體積比進行(xing)稀釋（1份濃縮洗(xi)(xi)滌(di)液(ye)+9份去離子水）。
3. 70%甲(jia)醇(chun)水(shui)：將甲(jia)醇(chun)用(yong)去離子(zi)水(shui)按70:30體積比進行稀釋（7份(fen)無水(shui)甲(jia)醇(chun)+3份(fen)去離子(zi)水(shui)）。
【樣本前處理步驟】
花生醬(jiang)(jiang)(jiang)、芝麻醬(jiang)(jiang)(jiang)、蛋黃(huang)醬(jiang)(jiang)(jiang)、面粉(fen)、餅(bing)干、蛋糕(gao)等食品(pin)，各種飼料及花生粕、豆粕、麥麩、DDGS等原料（稀(xi)釋倍數：5）
1. 取10g粉碎(sui)的樣(yang)(yang)品與50ml 70%甲(jia)醇水混合(he)均勻(yun)（可根據提取容器，等比例適量(liang)調整樣(yang)(yang)品量(liang)和(he)甲(jia)醇水的量(liang)）；
2. 高速(su)均質(zhi)2min或(huo)振蕩提取5min；
3. 2000g離心(xin)5min或定(ding)性濾紙過濾；
4. 取100μl上清液待測。
【檢測步驟】
一、 測定前須知：
1. 使(shi)用之前將(jiang)所有(you)試(shi)劑和所需板條回溫(wen)（20～25℃）。
2. 使用之后(hou)立即將(jiang)所有(you)試(shi)劑(ji)(ji)及(ji)剩余板條(tiao)放置2～8℃，干燥環境保(bao)(bao)存有(you)利于保(bao)(bao)持試(shi)劑(ji)(ji)穩(wen)定性(xing)。
3. ELISA分析中的再現性，很大程(cheng)度上取(qu)決于洗板的一致性，正確的洗板操作(zuo)(zuo)是ELISA操作(zuo)(zuo)中的要點。
4. 在所有(you)恒溫孵育過程中(zhong)，避(bi)免光線照射。用蓋(gai)板膜封住微孔板。
二、操作步驟：
1. 將所(suo)需試劑(ji)及微孔板取(qu)出，放置(zhi)室溫(wen)（20～25℃）30min以上，液體(ti)試劑(ji)使用前(qian)均(jun)須搖勻。
2. 取(qu)出(chu)所需數量的微(wei)孔板，將(jiang)不用(yong)的微(wei)孔板與干燥劑(ji)一起重新真空(kong)密封，放置于2～8℃。不可冷(leng)凍(dong)。
3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。
4. 將樣(yang)本和標(biao)準(zhun)品(pin)對應(ying)微孔(kong)編號，每個樣(yang)本和標(biao)準(zhun)品(pin)做2孔(kong)平行(xing)，并記錄標(biao)準(zhun)孔(kong)和樣(yang)本孔(kong)所在的位置。
5. 每孔中加入60μl樣品稀釋液。
6. 加標準品/樣本30μl到對應的微孔中，加入酶標物50μl/孔，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)振蕩(dang)混勻，用蓋(gai)板膜蓋(gai)板后置室溫避光(guang)反(fan)應15min。
7. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間(jian)隔(ge)30s，用吸水紙(zhi)拍(pai)干。
8. 加入顯色液100μl/孔(kong)，輕輕振蕩混(hun)勻，用蓋板膜蓋板后(hou)置室溫(wen)避光反應15min。
9. 加終止液50μl/孔，輕(qing)輕(qing)振(zhen)蕩混勻，設酶標儀于450nm處讀取每孔OD值。
【結果判定】
1. 百分吸光率的計算
標(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品或樣本(ben)的(de)(de)(de)百分吸光(guang)率等于標(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品或樣本(ben)的(de)(de)(de)百分吸光(guang)度(du)值(zhi)的(de)(de)(de)平均(jun)值(zhi)（雙孔）除(chu)以第一個標(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)（0標(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)）的(de)(de)(de)吸光(guang)度(du)值(zhi)，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—標準溶(rong)(rong)液或樣(yang)本溶(rong)(rong)液的平均吸光(guang)度值
B0—0(ppb)標(biao)準溶液的平均吸光度值
2. 標準曲線的繪制與計算
以(yi)標(biao)準品百分吸(xi)光率為(wei)縱坐標(biao)，黃曲霉毒素B1標(biao)準品濃度（ppb）的(de)對數(shu)為(wei)橫坐標(biao)，繪制標(biao)準曲線(xian)圖。將(jiang)樣本的(de)百分吸(xi)光率代(dai)入(ru)標(biao)準曲線(xian)中，從標(biao)準曲線(xian)上讀(du)出樣本所對應的(de)濃度，乘以(yi)其對應的(de)稀釋倍數(shu)即為(wei)樣本中黃曲霉毒素B1實際含量。
【注意事項】
1. 室(shi)溫低于20℃或試劑及(ji)樣本沒有(you)(you)恢復到(dao)室(shi)溫（20～25℃）會導致(zhi)所有(you)(you)標準(zhun)的(de)OD值偏(pian)低。
2. 在洗板過程中如(ru)果出現(xian)板孔干(gan)燥的(de)情況，則會出現(xian)標準(zhun)曲線不成線性(xing)，重(zhong)復性(xing)不好的(de)現(xian)象。所以洗板拍干(gan)后應(ying)立(li)即進行(xing)下一步操作。
3. 每種試劑使用前均(jun)需搖勻。
4. 反應(ying)終止液為0.5M硫(liu)酸，避(bi)免接觸皮膚(fu)。
5. 不要使(shi)(shi)用(yong)過了有(you)(you)效(xiao)期的(de)試(shi)劑(ji)盒；也不要摻(chan)雜使(shi)(shi)用(yong)過了有(you)(you)效(xiao)期的(de)試(shi)劑(ji)盒；盡量不要交(jiao)換使(shi)(shi)用(yong)不同(tong)批號試(shi)劑(ji)盒中的(de)試(shi)劑(ji)。
6. 儲存條(tiao)件：
試劑盒保存(cun)于2～8℃，不能冷凍，將不用的微孔板重新(xin)真空密封。標準(zhun)物(wu)質和無色(se)的顯色(se)劑對光敏感，因此要避光保存(cun)。
7. 試劑變質的跡(ji)象：
顯(xian)色試劑有任何顏色表明顯(xian)色劑變質，應當(dang)棄之。0標準的吸光度(du)（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質。
8. 加(jia)入顯(xian)(xian)色液后，一般顯(xian)(xian)色時(shi)(shi)間為(wei)15～30min。若顏色較淺(qian)，可延長反(fan)應(ying)時(shi)(shi)間到35min（或更(geng)長），但(dan)不(bu)得(de)超過40min。反(fan)之，則減短反(fan)應(ying)時(shi)(shi)間。
9. 該試劑盒最佳反(fan)應(ying)溫度(du)為(wei)25℃，溫度(du)過高或過低將導(dao)致檢(jian)測吸光(guang)度(du)值和靈敏度(du)發(fa)生變化。
【樣品最低檢測限】
飼料(liao)等……………………………………… 5ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件：保存試(shi)劑(ji)盒于2～8℃。
保存期：該(gai)產品(pin)有效期為12個月。
