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黃曲霉毒素B1（Ⅲ型）ELISA檢測試劑盒說明書
【概要】
黃曲(qu)霉(mei)(mei)毒素是曲(qu)霉(mei)(mei)菌屬的(de)(de)黃曲(qu)霉(mei)(mei)和(he)寄生(sheng)(sheng)曲(qu)霉(mei)(mei)的(de)(de)二次(ci)代謝產物(wu)(wu)，是自然界最(zui)危險(xian)的(de)(de)致癌物(wu)(wu)質之一，廣泛存在于谷物(wu)(wu)、堅果(guo)、棉籽以(yi)(yi)及(ji)以(yi)(yi)此為原料生(sheng)(sheng)產的(de)(de)各種食品(pin)、油料、酒類(lei)、飼(si)料中，并能(neng)通過動物(wu)(wu)體(ti)產生(sheng)(sheng)同(tong)樣有害的(de)(de)代謝產物(wu)(wu)，存在于牛奶及(ji)奶制品(pin)，肉類(lei)甚至人體(ti)血(xue)液(ye)，組織中。
黃曲霉毒(du)素(su)(su)中毒(du)性(xing)最(zui)強的(de)(de)是黃曲霉毒(du)素(su)(su)B1，是世界衛生組織規定(ding)(ding)的(de)(de)I類致(zhi)(zhi)癌物質，毒(du)性(xing)是砒霜(shuang)的(de)(de)68倍，其(qi)幾乎一(yi)直(zhi)和(he)黃曲霉毒(du)素(su)(su)B2、G1 和(he) G2共存，是肝(gan)癌的(de)(de)三(san)大致(zhi)(zhi)病因素(su)(su)之首。世界大部分國家和(he)地區都已對食品和(he)飼料(liao)中的(de)(de)黃曲霉毒(du)素(su)(su)最(zui)高允許(xu)水平作(zuo)了規定(ding)(ding)，因此，準確測定(ding)(ding)食品及(ji)飼料(liao)中的(de)(de)黃曲霉毒(du)素(su)(su)含量(liang)對于(yu)食品安全監控具(ju)有重要意義(yi)。
【適用范圍】
可(ke)定性、定量檢測(ce)嬰兒配方食(shi)(shi)品，嬰兒輔助食(shi)(shi)品等樣本中的黃曲(qu)霉毒素B1。
【試驗原理】
本試劑盒采(cai)用競(jing)爭(zheng)(zheng)ELISA原理，在微孔板(ban)上(shang)(shang)預包被(bei)黃曲(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)毒素(su)(su)B1抗體，加(jia)入(ru)樣本/黃曲(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)毒素(su)(su)B1標(biao)準(zhun)(zhun)品溶液(ye)及(ji)辣(la)根過氧(yang)化物(wu)酶(mei)標(biao)記的(de)(de)(de)(de)黃曲(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)毒素(su)(su)B1抗原。樣本或標(biao)準(zhun)(zhun)品溶液(ye)中的(de)(de)(de)(de)黃曲(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)毒素(su)(su)B1與辣(la)根過氧(yang)化物(wu)酶(mei)標(biao)記的(de)(de)(de)(de)黃曲(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)毒素(su)(su)B1抗原競(jing)爭(zheng)(zheng)結(jie)合預包被(bei)在微孔板(ban)上(shang)(shang)的(de)(de)(de)(de)黃曲(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)毒素(su)(su)B1抗體。未(wei)結(jie)合的(de)(de)(de)(de)酶(mei)標(biao)抗原在洗滌時被(bei)除(chu)去。再加(jia)入(ru)TMB顯色液(ye)，讀取吸光(guang)值。樣本的(de)(de)(de)(de)吸光(guang)值與其所(suo)含(han)殘(can)留物(wu)黃曲(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)毒素(su)(su)B1的(de)(de)(de)(de)含(han)量成(cheng)負相關。對(dui)照標(biao)準(zhun)(zhun)曲(qu)線(xian)，即(ji)可得出相應殘(can)留物(wu)黃曲(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)毒素(su)(su)B1的(de)(de)(de)(de)含(han)量。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏(min)度：10ppt（0.01ppb）
【交叉反應率】
結構類似物 交叉反應率
黃曲霉毒(du)素B1 …………………………………………………………… 100%
黃曲(qu)霉毒素B2 …………………………………………………………… 15%
黃曲(qu)霉(mei)毒素G1 …………………………………………………………… 11%
黃曲(qu)霉毒(du)素G2 …………………………………………………………… 4%
黃曲霉毒(du)素M1 …………………………………………………………… 0.5%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標(biao)準(zhun)液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppt,10ppt,20ppt, 40ppt, 80ppt,160ppt
3. 酶標物1瓶(ping) ……………………………………………6ml
4. 顯(xian)色液(ye)1瓶(ping) …………………………………………12ml
5. 終止液1瓶 …………………………………………10ml
6. 濃(nong)縮(suo)洗(xi)滌液(ye) （10×）1瓶………………………… 50ml
7. 濃(nong)縮樣品稀釋液（10×）1瓶 ……………………50ml
【需要而未提供的設備及試劑】
設備：
┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm
┅┅振蕩(dang)器(qi)
┅┅粉碎機
┅┅離心機
┅┅天平：感量0.01g
┅┅微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl、八道300μl
試劑：
┅┅甲醇（分析純）
┅┅去(qu)離子水（或蒸餾水）
【試劑配制】
1. 樣(yang)品(pin)稀(xi)(xi)釋液(ye)(ye)：將濃(nong)(nong)縮樣(yang)品(pin)稀(xi)(xi)釋液(ye)(ye)用去離子水(shui)按1:9體積(ji)比進行稀(xi)(xi)釋（1份濃(nong)(nong)縮樣(yang)品(pin)稀(xi)(xi)釋液(ye)(ye)+9份去離子水(shui)）。
2. 洗滌(di)工作液：將濃縮洗滌(di)液用去離(li)(li)子水按1:9體積(ji)比進行稀釋(shi)（1份濃縮洗滌(di)液+9份去離(li)(li)子水）。
3. 80%甲醇水：將甲醇用(yong)去離子水按80:20體積比(bi)進行稀(xi)釋（8份(fen)無水甲醇+2份(fen)去離子水）。
【樣本前處理步驟】
嬰(ying)幼兒配方食品(pin)，輔(fu)助食品(pin)等(deng)（稀釋(shi)倍數：24）
1. 取3.0g粉碎的(de)樣品與9.0ml 80%甲醇混合均勻；
2. 強力振蕩3min；
3. 2000g離心(xin)10min；
4. 取上層清液100μl，加入700μl樣品稀釋液，混合均勻；
5. 取100μl稀(xi)釋后(hou)液體待測(ce)。
【檢測步驟】
一、 測定前須知：
1. 使用(yong)之前將(jiang)所有試劑和所需板條(tiao)回溫（20～25℃）。
2. 使用之后立即將所(suo)有試劑及(ji)剩(sheng)余板(ban)條放置(zhi)2～8℃。
3. ELISA分析中(zhong)的再(zai)現性，很大程度上(shang)取決于洗(xi)板(ban)的一致性，正(zheng)確的洗(xi)板(ban)操作(zuo)是ELISA操作(zuo)中(zhong)的要點(dian)。
4. 在所有(you)恒(heng)溫孵(fu)育過程(cheng)中(zhong)，避免光線照射(she)，用蓋板膜(mo)封住微孔板。
二、操作步驟：
1. 將所需試劑(ji)及微孔板取出(chu)，放(fang)置室溫(wen)（20～25℃）30min以上，液(ye)體試劑(ji)使用前均須搖勻。
2. 取出所需(xu)數量的微孔板(ban)(ban)，將不用的微孔板(ban)(ban)與干燥劑一起重(zhong)新真空密封，放置于2～8℃。不可冷(leng)凍。
3. 洗(xi)滌工作(zuo)液在使(shi)用前(qian)也需回溫。
4. 將樣(yang)本(ben)和(he)標(biao)準(zhun)品對應(ying)微孔(kong)編號，每(mei)個樣(yang)本(ben)和(he)標(biao)準(zhun)品做2孔(kong)平(ping)行，并記錄標(biao)準(zhun)孔(kong)和(he)樣(yang)本(ben)孔(kong)所在(zai)的位置。
5. 加標準品/樣本100μl到(dao)對應(ying)的微孔中，用蓋板膜(mo)蓋板后置室溫避(bi)光反應(ying)15min。
6. 再加入酶標物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后(hou)置室溫(wen)避光反(fan)應5min。
7. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔(kong)，洗(xi)板5次(ci)，每次(ci)間隔30s，用吸(xi)水紙(zhi)拍干。
8. 加入顯色液100μl/孔，輕(qing)輕(qing)振蕩混勻，用(yong)蓋(gai)板膜蓋(gai)板后置室溫避(bi)光反(fan)應15min。
9. 加終止液50μl/孔(kong)，輕輕振(zhen)蕩混勻，設(she)酶標儀于450nm處讀取每孔(kong)OD值。
【結果判定】
1. 百分吸光率的計算
標準(zhun)品或樣本的百分吸光率等于標準(zhun)品或樣本的百分吸光度值(zhi)(zhi)的平(ping)均值(zhi)(zhi)（雙孔(kong)）除以(yi)(yi)第一個標準(zhun)（0標準(zhun)）的吸光度值(zhi)(zhi)，再乘以(yi)(yi)100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—標準溶(rong)液或樣本溶(rong)液的平(ping)均(jun)吸(xi)光度值
B0—0(ppb)標準溶液(ye)的平均吸光度值
2. 標準曲線的繪制與計算
以標(biao)(biao)準(zhun)(zhun)品百分吸(xi)光率為(wei)(wei)縱坐標(biao)(biao)，黃(huang)曲(qu)霉(mei)(mei)毒素(su)B1標(biao)(biao)準(zhun)(zhun)品濃度(du)（ppb）的(de)對(dui)數(shu)為(wei)(wei)橫(heng)坐標(biao)(biao)，繪(hui)制標(biao)(biao)準(zhun)(zhun)曲(qu)線圖。將(jiang)樣本(ben)的(de)百分吸(xi)光率代入(ru)標(biao)(biao)準(zhun)(zhun)曲(qu)線中(zhong)(zhong)，從標(biao)(biao)準(zhun)(zhun)曲(qu)線上(shang)讀出樣本(ben)所對(dui)應的(de)濃度(du)，乘以其對(dui)應的(de)稀釋倍數(shu)即為(wei)(wei)樣本(ben)中(zhong)(zhong)黃(huang)曲(qu)霉(mei)(mei)毒素(su)B1實際含量。
【注意事項】
1. 室溫(wen)低于20℃或試(shi)劑及樣本沒有(you)恢(hui)復到(dao)室溫(wen)（20～25℃）會導致(zhi)所有(you)標(biao)準的OD值偏低。
2. 在洗(xi)板過程中(zhong)如果出現(xian)板孔干(gan)燥的(de)情況，則會出現(xian)標準曲線(xian)不成線(xian)性，重復性不好(hao)的(de)現(xian)象(xiang)。所以洗(xi)板拍干(gan)后應立(li)即進行下一(yi)步操作。
3. 每種試劑使用前均需搖勻。
4. 反應(ying)終止液為0.5M硫酸，避免接觸皮膚。
5. 不(bu)(bu)要(yao)使(shi)用過(guo)了有(you)效期(qi)的(de)試(shi)劑(ji)盒(he)(he)；也不(bu)(bu)要(yao)摻雜使(shi)用過(guo)了有(you)效期(qi)的(de)試(shi)劑(ji)盒(he)(he)；不(bu)(bu)要(yao)交(jiao)換使(shi)用不(bu)(bu)同批號試(shi)劑(ji)盒(he)(he)中(zhong)的(de)試(shi)劑(ji)。
6. 儲存條件：
試劑(ji)盒(he)保(bao)存于2～8℃，不能冷凍，將(jiang)不用的微孔(kong)板重新真空密封(feng)。標準物質(zhi)和無色(se)的顯(xian)色(se)劑(ji)對光敏感，因此要避光保(bao)存。
7. 試劑變質的跡象：
顯色(se)試(shi)劑(ji)(ji)有任何顏色(se)表(biao)(biao)明顯色(se)劑(ji)(ji)變質，應當棄之。0標(biao)準的吸(xi)光度（450/630nm）值小(xiao)于(yu)0.5（A450nm<0.5）時，表(biao)(biao)示(shi)試(shi)劑(ji)(ji)可能變質。
8. 加入(ru)顯色(se)(se)液后，一般顯色(se)(se)時(shi)間為15～30min。若顏色(se)(se)較淺(qian)，可延長反應時(shi)間到35min（或更長），但不(bu)得超過40min。反之(zhi)，則減短反應時(shi)間。
9. 該試劑盒(he)最(zui)佳反應溫度為25℃，溫度過(guo)高或過(guo)低將導(dao)致檢(jian)測(ce)吸(xi)光度值(zhi)和靈敏度發生變化。
【樣品檢測范圍】
嬰幼(you)兒配方食品(pin)、嬰幼(you)兒輔(fu)助食品(pin)………………………………………0.24ppb — 3.84ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件：保存試(shi)劑盒于(yu)2～8℃。
保存期：該產品有效期為12個月。
