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黃曲霉毒素M1（Ⅰ型）ELISA檢測試劑盒說明書
【概要】
黃(huang)(huang)曲(qu)霉(mei)(mei)毒素是一類真菌（如(ru)黃(huang)(huang)曲(qu)霉(mei)(mei)和寄生曲(qu)霉(mei)(mei)）的有毒的代(dai)謝產(chan)(chan)物(wu)，它們具有很強的致(zhi)癌(ai)性，主要存在于谷(gu)物(wu)、堅果(guo)、棉(mian)籽以(yi)及一些與(yu)人類血液，動物(wu)飼料相關的產(chan)(chan)品中(zhong)。黃(huang)(huang)曲(qu)霉(mei)(mei)毒素M1是黃(huang)(huang)曲(qu)霉(mei)(mei)毒素B1的羥基化代(dai)謝產(chan)(chan)物(wu)，也(ye)是一種強致(zhi)癌(ai)物(wu)質(zhi)。牛(niu)乳及其制品是易受(shou)到黃(huang)(huang)曲(qu)霉(mei)(mei)毒素M1污(wu)染(ran)的食(shi)品之一。Aflatoxin M1的檢測方法(fa)有高(gao)效液相色譜(pu)法(fa)(HPLC)，薄層層析法(fa)(TLC)等。而使用黃(huang)(huang)曲(qu)霉(mei)(mei)毒素M1 ELISA試劑盒(he)則能(neng)夠快速(su)而準確的分(fen)析樣品中(zhong)黃(huang)(huang)曲(qu)霉(mei)(mei)毒素M1殘留(liu)。
【適用范圍】
可(ke)定性、定量(liang)檢測牛奶，奶粉等樣本中的黃曲霉毒素M1的含量(liang)。
【試驗原理】
本(ben)(ben)試劑盒(he)采用競爭ELISA原(yuan)理，在微孔板上預(yu)包被黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)毒(du)素抗原(yuan)，加入樣本(ben)(ben)/黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)毒(du)素M1標(biao)(biao)(biao)準(zhun)品溶液(ye)(ye)及(ji)辣根過(guo)氧化(hua)物酶標(biao)(biao)(biao)記的(de)(de)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)毒(du)素M1抗體(ti)。樣本(ben)(ben)或(huo)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)品溶液(ye)(ye)中的(de)(de)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)毒(du)素M1與(yu)預(yu)包被在微孔板上的(de)(de)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)毒(du)素抗原(yuan)競爭結(jie)(jie)合(he)辣根過(guo)氧化(hua)物酶標(biao)(biao)(biao)記的(de)(de)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)毒(du)素M1抗體(ti)。未(wei)結(jie)(jie)合(he)的(de)(de)酶標(biao)(biao)(biao)抗體(ti)在洗滌時被除去。再加入TMB顯(xian)色(se)液(ye)(ye)，讀取吸光(guang)值。樣本(ben)(ben)的(de)(de)吸光(guang)值與(yu)其所含(han)殘(can)(can)留物黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)毒(du)素M1的(de)(de)含(han)量成負相(xiang)關。對照(zhao)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)(qu)線，即可得出(chu)相(xiang)應殘(can)(can)留物黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)(mei)毒(du)素M1的(de)(de)含(han)量。
【試劑盒靈敏度】
試劑(ji)盒(he)靈敏度：0.1ppb
【交叉反應率】
結構類似物 交叉反應率
黃曲(qu)霉毒(du)素B1 …………………………………………………………… 30%
黃(huang)曲霉毒素B2 …………………………………………………………… 5%
黃(huang)曲霉毒素(su)G1 …………………………………………………………… 15%
黃曲霉(mei)毒素G2 …………………………………………………………… 7%
黃曲霉毒素M1 …………………………………………………………… 100%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊(kuai)
2. 標準(zhun)液×6瓶(ping)：（2ml/瓶(ping)）
0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb
3. 濃縮酶標記物 1瓶 ………………………………… 1ml
4. 酶標稀(xi)釋液1瓶 …………………………………… 7ml
5. 顯色液(ye)1瓶 ………………………………………… 12ml
6. 終止液1瓶(ping) ………………………………………… 10ml
7. 濃縮洗滌(di)液 （10×）1瓶 ……………………… 50ml
【需要而未提供的設備及試劑】
設備：
┅┅微孔(kong)板酶標儀450nm/630nm
┅┅振(zhen)蕩器
┅┅離心(xin)機
┅┅天平：感(gan)量(liang)0.01g
┅┅微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl，八道 300μl
試劑：
┅┅去(qu)離子水
【試劑配制】
1. 洗(xi)滌工(gong)作液：將濃(nong)縮洗(xi)滌液用去離(li)(li)子水按1:9體(ti)積比(bi)進行稀釋(shi)（1份濃(nong)縮洗(xi)滌液+9份去離(li)(li)子水）。
2. 酶(mei)標物的配(pei)制(現用(yong)現配(pei)，避光保存)：將(jiang)濃縮酶(mei)標記(ji)物與酶(mei)標稀(xi)釋(shi)(shi)液按1：19體(ti)積比進行(xing)稀(xi)釋(shi)(shi)（1份酶(mei)濃縮液+19份酶(mei)標稀(xi)釋(shi)(shi)液。
【樣本前處理步驟】
一、 牛奶（稀釋倍數：1）
1. 取待(dai)測(ce)樣品，7000rpm室溫下離心，5min；
2. 取(qu)下(xia)層100μl待(dai)測。
二、 奶粉（稀釋倍數：5）
1. 取1.0g奶粉，加(jia)入5ml去(qu)離子水，混勻；
2. 7000rpm室溫下(xia)離心，5min；
3. 取下層100μl待測。
【檢測步驟】
一、測定前須知：
1. 使用之前將所(suo)有(you)試劑和所(suo)需板條回溫（20～25℃）。
2. 使用之后(hou)立即將所有試劑及剩余板條放置2～8℃。
3. ELISA分(fen)析中(zhong)的(de)(de)再(zai)現性，很大程(cheng)度上取決于洗(xi)板的(de)(de)一致性，正確的(de)(de)洗(xi)板操(cao)作是ELISA操(cao)作中(zhong)的(de)(de)要點。
4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔(kong)板。
二、操作步驟：
1. 將(jiang)所需試劑及微孔板(ban)取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻(yun)。
2. 取(qu)出(chu)所需(xu)數量(liang)的微(wei)孔(kong)板(ban)，將(jiang)不用的微(wei)孔(kong)板(ban)與干燥(zao)劑一(yi)起重新真(zhen)空密封(feng)，放置于2～8℃。不可冷(leng)凍。
3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。
4. 將(jiang)樣(yang)本(ben)(ben)和標(biao)準品對應微孔(kong)編(bian)號，每(mei)個(ge)樣(yang)本(ben)(ben)和標(biao)準品做2孔(kong)平行(xing)，并(bing)記(ji)錄標(biao)準孔(kong)和樣(yang)本(ben)(ben)孔(kong)所在(zai)的位置。
5. 加標準品/樣本50μl到對應的微孔中，加入酶標物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板(ban)膜蓋板(ban)后置室溫避光反應30min。
6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔(kong)，洗板(ban)5次(ci)，每次(ci)間隔(ge)30s，用吸(xi)水紙拍干。
7. 加入顯色液100μl/孔，輕(qing)輕(qing)振蕩(dang)混(hun)勻，用蓋板膜蓋板后置室(shi)溫避光反應(ying)30min。
8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(she)酶(mei)標儀于450nm處讀取每孔OD值(zhi)。
【結果判定】
1. 百分吸光率的計算
標(biao)準品或(huo)(huo)樣(yang)本的(de)百(bai)(bai)分吸光(guang)率(lv)等于標(biao)準品或(huo)(huo)樣(yang)本的(de)百(bai)(bai)分吸光(guang)度值(zhi)(zhi)的(de)平均值(zhi)(zhi)（雙孔）除(chu)以(yi)第一(yi)個標(biao)準（0標(biao)準）的(de)吸光(guang)度值(zhi)(zhi)，再乘(cheng)以(yi)100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—標準(zhun)溶液或樣本溶液的平均吸光度值(zhi)
B0—0(ppb)標(biao)準溶液的平均(jun)吸光度值
2. 標準曲線的繪制與計算
以標準(zhun)品(pin)百分吸光率為縱坐標，黃曲霉毒(du)(du)素(su)(su)M1標準(zhun)品(pin)濃度（ppb）的對(dui)(dui)數(shu)為橫坐標，繪制標準(zhun)曲線(xian)圖。將樣本(ben)的百分吸光率代入標準(zhun)曲線(xian)中(zhong)，從(cong)標準(zhun)曲線(xian)上讀出(chu)樣本(ben)所對(dui)(dui)應的濃度，乘以其對(dui)(dui)應的稀(xi)釋倍數(shu)即為樣本(ben)中(zhong)黃曲霉毒(du)(du)素(su)(su)M1實際(ji)含量。
【注意事項】
1. 室溫低于(yu)20℃或試(shi)劑及樣本(ben)沒有(you)(you)恢復到室溫（20～25℃）會導致(zhi)所有(you)(you)標準的OD值偏低。
2. 在洗(xi)板過程(cheng)中如果出現板孔干燥的情況，則會(hui)出現標準曲線不(bu)成(cheng)線性，重復性不(bu)好的現象。所(suo)以(yi)洗(xi)板拍干后應立即進行下一步操作。
3. 每種試劑(ji)使用前均需搖勻(yun)。
4. 反應(ying)終止液為(wei)0.5M硫酸，避免接觸皮膚。
5. 不(bu)(bu)要(yao)(yao)使(shi)用(yong)過了(le)有效期的(de)試(shi)劑(ji)盒(he)；也(ye)不(bu)(bu)要(yao)(yao)摻雜使(shi)用(yong)過了(le)有效期的(de)試(shi)劑(ji)盒(he)；不(bu)(bu)要(yao)(yao)交換(huan)使(shi)用(yong)不(bu)(bu)同(tong)批號試(shi)劑(ji)盒(he)中的(de)試(shi)劑(ji)。
6. 儲存條件：
試(shi)劑(ji)盒保存(cun)(cun)于2～8℃，不能(neng)冷凍，將不用的微(wei)孔(kong)板(ban)重新(xin)真空密封(feng)。標準物質(zhi)和無色(se)的顯色(se)劑(ji)對光(guang)敏感，因此要避光(guang)保存(cun)(cun)。
7. 試劑變質的跡象：
顯(xian)色試劑有任何(he)顏色表(biao)明顯(xian)色劑變(bian)質(zhi)(zhi)，應(ying)當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時，表(biao)示(shi)試劑可能變(bian)質(zhi)(zhi)。
8. 加入顯色液后，一般顯色時間為15～30min。若顏色較(jiao)淺，可延長反應(ying)時間到(dao)35min（或更長），但不得超(chao)過40min。反之，則減(jian)短反應(ying)時間。
9. 該試劑盒最佳反應溫(wen)度為(wei)25℃，溫(wen)度過高或過低將導(dao)致檢測吸(xi)光度值和靈(ling)敏度發生變化。
【樣品最低檢測限】
牛奶………………………………………………0.1ppb
奶粉(fen)………………………………………………0.5ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件：保存試劑盒(he)于2～8℃。
保存期：該產品有(you)效期為(wei)12個月(yue)。
