|
|
 |
 |
 |
黃曲霉毒素M1（Ⅱ型）高靈敏度ELISA檢測試劑盒說明書
【概要】
黃(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素(su)是(shi)(shi)一(yi)類真菌(jun)（如黃(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)和(he)寄生曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)）的(de)(de)(de)有毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)代謝(xie)產物(wu)，它們具有很強的(de)(de)(de)致癌性，主要(yao)存(cun)在于谷物(wu)、堅果(guo)、棉籽以及一(yi)些與人(ren)類血液，動物(wu)飼料相關的(de)(de)(de)產品中。黃(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素(su)M1是(shi)(shi)黃(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素(su)B1的(de)(de)(de)羥基化(hua)代謝(xie)產物(wu)，也是(shi)(shi)一(yi)種強致癌物(wu)質。牛乳(ru)及其制品是(shi)(shi)易受到黃(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素(su)M1污染的(de)(de)(de)食品之一(yi)。Aflatoxin M1的(de)(de)(de)檢測(ce)方法(fa)有高(gao)效液相色譜法(fa)(HPLC)，薄層層析法(fa)(TLC)等(deng)。而使用黃(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素(su)M1 ELISA試劑(ji)盒則能夠快(kuai)速而準確的(de)(de)(de)分(fen)析樣品中黃(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)毒(du)(du)(du)素(su)M1殘留。
【適用范圍】
可定性(xing)、定量(liang)檢測牛(niu)奶，奶粉等樣本中的(de)黃曲霉毒素M1的(de)含量(liang)。
【試驗原理】
本試(shi)劑盒采(cai)用競爭(zheng)ELISA原(yuan)(yuan)理(li)，在(zai)微孔(kong)板(ban)上預包被黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)毒(du)(du)(du)素(su)抗原(yuan)(yuan)，加(jia)入樣本/黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)毒(du)(du)(du)素(su)M1標(biao)準(zhun)品溶(rong)液及辣(la)根過(guo)氧化物(wu)酶標(biao)記的(de)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)毒(du)(du)(du)素(su)M1抗體。樣本或標(biao)準(zhun)品溶(rong)液中的(de)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)毒(du)(du)(du)素(su)M1與預包被在(zai)微孔(kong)板(ban)上的(de)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)毒(du)(du)(du)素(su)抗原(yuan)(yuan)競爭(zheng)結合辣(la)根過(guo)氧化物(wu)酶標(biao)記的(de)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)毒(du)(du)(du)素(su)M1抗體。未結合的(de)酶標(biao)抗體在(zai)洗(xi)滌(di)時被除(chu)去(qu)。再加(jia)入TMB顯色液，讀取(qu)吸光值(zhi)(zhi)。樣本的(de)吸光值(zhi)(zhi)與其所含(han)殘留物(wu)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)毒(du)(du)(du)素(su)M1的(de)含(han)量成負(fu)相關(guan)。對照標(biao)準(zhun)曲(qu)(qu)線，即(ji)可得出相應殘留物(wu)黃(huang)曲(qu)(qu)霉(mei)毒(du)(du)(du)素(su)M1的(de)含(han)量。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏(min)度(du)：0.02ppb
【交叉反應率】
結構類似物 交叉反應率
黃曲霉毒素B1 …………………………………………………………… 30%
黃(huang)曲霉毒素B2 …………………………………………………………… 5%
黃曲霉(mei)毒素(su)G1 …………………………………………………………… 15%
黃曲霉毒素G2 …………………………………………………………… 7%
黃曲霉(mei)毒素(su)M1 …………………………………………………………… 100%
【試劑盒組成】
1. 96孔(kong)板×1塊
2. 標準液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppt, 20ppt, 50ppt, 100ppt, 250ppt, 500ppt
3. 濃(nong)縮酶標記物 1瓶 …………………………………… 1ml
4. 酶(mei)標稀釋液1瓶 ………………………………………… 7ml
5. 顯色液1瓶 …………………………………………… 12ml
6. 終止(zhi)液1瓶(ping) …………………………………………… 10ml
7. 濃(nong)縮樣本稀釋(shi)液（20×）1瓶(ping) …………………… 50ml
8. 濃(nong)縮洗滌液(ye) （10×）1瓶 ………………………… 50ml
【需要而未提供的設備及試劑】
設備：
┅┅微孔板酶標(biao)儀(yi)450nm/630nm
┅┅振蕩(dang)器
┅┅離心機(ji)
┅┅天平：感量(liang)0.01g
┅┅微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl， 八道 300μl
試劑：
┅┅去(qu)離子水(shui)（或蒸餾水(shui)）
【試劑配制】
1. 洗(xi)滌工作液：將濃(nong)(nong)縮(suo)洗(xi)滌液用去離子水(shui)按(an)1:9體積(ji)比進行稀釋(shi)（1份濃(nong)(nong)縮(suo)洗(xi)滌液+9份去離子水(shui)）。
2. 酶(mei)(mei)標(biao)(biao)物的配制(現用(yong)現配，避光保存)：將濃縮酶(mei)(mei)標(biao)(biao)記物與酶(mei)(mei)標(biao)(biao)稀釋(shi)(shi)液按1：19體積比進行稀釋(shi)(shi)（1份(fen)(fen)酶(mei)(mei)濃縮液+19份(fen)(fen)酶(mei)(mei)標(biao)(biao)稀釋(shi)(shi)液）
【樣本前處理步驟】
一、 牛奶（稀釋倍數：1）
1. 取待測樣品(pin)7000rpm室(shi)溫下離心(xin)，10min；
2. 取200ul下層待(dai)測。
二、 奶粉（稀釋倍數：5）
1. 取(qu)2.0g奶粉，加(jia)入10ml樣本稀(xi)釋液，混勻；
2. 7000rpm室溫下離(li)心，10min；
3. 取(qu)下層200μl待測(ce)。
【檢測步驟】
一、測定前須知：
1. 使用之前將所有試劑和(he)所需(xu)板(ban)條回溫（20～25℃）。
2. 使(shi)用(yong)之后立即將所有試(shi)劑及剩(sheng)余板(ban)條放置2～8℃。
3. ELISA分析中的(de)再現性，很(hen)大程度(du)上(shang)取決(jue)于洗板(ban)的(de)一致(zhi)性，正確的(de)洗板(ban)操作(zuo)是ELISA操作(zuo)中的(de)要(yao)點。
4. 在所有恒溫孵育過(guo)程中，避(bi)免(mian)光線照射，用蓋板膜封住(zhu)微(wei)孔(kong)板。
二、操作步驟：
1. 將所需試劑(ji)(ji)及微孔板取出，放置(zhi)室溫(wen)（20～25℃）30min以上，液體試劑(ji)(ji)使用前(qian)均須搖勻。
2. 取出所需數量(liang)的微(wei)(wei)孔板，將不(bu)(bu)用(yong)的微(wei)(wei)孔板與干燥(zao)劑一(yi)起重新真空密封，放置于2～8℃。不(bu)(bu)可冷凍(dong)。
3. 洗滌工作液(ye)在(zai)使用前(qian)也需(xu)回溫。
4. 將樣本(ben)(ben)和標(biao)準品對應微孔編號，每個樣本(ben)(ben)和標(biao)準品做2孔平行，并記錄標(biao)準孔和樣本(ben)(ben)孔所(suo)在的位置。
5. 加標準品/樣本100μl到(dao)對應(ying)的微(wei)孔中，輕(qing)輕(qing)振蕩混(hun)勻(yun)，用蓋板膜(mo)蓋板后置室溫避(bi)光反(fan)應(ying)30min。
6. 小心揭開蓋板膜，加入酶標物50μl/孔，用蓋(gai)板膜蓋(gai)板后(hou)置室(shi)溫(wen)避光(guang)反(fan)應5min。
7. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗(xi)板5次(ci)，每(mei)次(ci)間隔30s，用吸水紙拍干。
8. 加入顯色液100μl/孔，輕(qing)輕(qing)振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫(wen)避光反應30min。
9. 加終止液50μl/孔，輕輕振(zhen)蕩混勻，設酶標儀于450nm處(chu)讀取每孔OD值(zhi)。
【結果判定】
1. 百分吸光率的計算
標準(zhun)品或(huo)樣本的百(bai)分吸(xi)光率等于標準(zhun)品或(huo)樣本的百(bai)分吸(xi)光度(du)值的平均值（雙孔）除以第一個(ge)標準(zhun)（0標準(zhun)）的吸(xi)光度(du)值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—標(biao)準溶(rong)液(ye)(ye)或樣本溶(rong)液(ye)(ye)的平均(jun)吸光度值
B0—0(ppb)標(biao)準溶液(ye)的平均吸光度值
2. 標準曲線的繪制與計算
以標(biao)準(zhun)(zhun)品百分吸光率為縱坐(zuo)(zuo)標(biao)，黃曲霉毒素M1標(biao)準(zhun)(zhun)品濃度（ppb）的(de)(de)對(dui)數(shu)為橫(heng)坐(zuo)(zuo)標(biao)，繪制標(biao)準(zhun)(zhun)曲線圖。將樣(yang)本的(de)(de)百分吸光率代入標(biao)準(zhun)(zhun)曲線中(zhong)(zhong)，從標(biao)準(zhun)(zhun)曲線上讀出樣(yang)本所對(dui)應的(de)(de)濃度，乘以其(qi)對(dui)應的(de)(de)稀釋(shi)倍數(shu)即為樣(yang)本中(zhong)(zhong)黃曲霉毒素M1實(shi)際含量。
【注意事項】
1. 室溫(wen)低于20℃或試劑及樣本沒有(you)恢(hui)復到室溫(wen)（20～25℃）會導致所有(you)標(biao)準的(de)OD值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現板孔(kong)干燥的情況，則(ze)會出現標準曲線(xian)不成(cheng)線(xian)性(xing)，重復(fu)性(xing)不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下(xia)一步操(cao)作。
3. 每種試劑使用前(qian)均(jun)需搖勻。
4. 反應(ying)終止液為0.5M硫(liu)酸，避免接觸皮(pi)膚。
5. 不(bu)要(yao)使用(yong)(yong)過了有效期(qi)的試劑(ji)盒(he)(he)；也(ye)不(bu)要(yao)摻雜使用(yong)(yong)過了有效期(qi)的試劑(ji)盒(he)(he)；不(bu)要(yao)交換(huan)使用(yong)(yong)不(bu)同批號試劑(ji)盒(he)(he)中的試劑(ji)。
6. 儲存條件：
試(shi)劑盒保(bao)存于(yu)2～8℃，不能冷凍，將不用的(de)微(wei)孔(kong)板重(zhong)新真空密封。標準物質和無色的(de)顯色劑對光敏(min)感，因(yin)此要避光保(bao)存。
7. 試劑變質的跡象：
顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變(bian)質，應當(dang)棄之。0標(biao)準的吸光度（450/630nm）值(zhi)小于0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能(neng)變(bian)質。
8. 加入顯(xian)色液(ye)后，一般顯(xian)色時(shi)(shi)間為(wei)15～30min。若顏色較(jiao)淺(qian)，可延長反(fan)應時(shi)(shi)間到(dao)35min（或更(geng)長），但不得超過40min。反(fan)之，則減短反(fan)應時(shi)(shi)間。
9. 該試劑盒最(zui)佳(jia)反應溫度為(wei)25℃，溫度過高或過低(di)將(jiang)導致檢測吸(xi)光度值和靈敏度發生變化。
【樣品最低檢測限】
牛奶 ………………………………………………… 0.02ppb
奶(nai)粉 ………………………………………………… 0.1ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件：保存試劑盒于2～8℃。
保存期：該產品有效期為12個月。
