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黃曲霉毒素總量(Aflatoxin Total)ELISA檢測試劑盒說明書
【概要】
黃曲霉(mei)(mei)毒(du)(du)素(su)(su)是一類(lei)真菌（主要是黃曲霉(mei)(mei)和(he)(he)寄生曲霉(mei)(mei)）代謝(xie)的(de)有毒(du)(du)產物(wu)，主要存在于谷物(wu)，堅果，棉籽以(yi)及(ji)一些與人(ren)類(lei)血液，動(dong)物(wu)飼料相關的(de)產品中(zhong)。黃曲霉(mei)(mei)毒(du)(du)素(su)(su)以(yi)AFB1、AFB2、AFG1和(he)(he)AFG2這四種(zhong)毒(du)(du)素(su)(su)為主，黃曲霉(mei)(mei)毒(du)(du)素(su)(su)總量一般是指這四種(zhong)毒(du)(du)素(su)(su)的(de)總量。它們(men)是I類(lei)致癌物(wu)，被(bei)證明對(dui)人(ren)和(he)(he)動(dong)物(wu)的(de)肝臟(zang)、腎臟(zang)等(deng)組織和(he)(he)器官具有很(hen)大(da)的(de)危(wei)害，是一類(lei)毒(du)(du)性很(hen)強的(de)致癌物(wu)質。因此，必須對(dui)其進(jin)行(xing)及(ji)時檢(jian)測(ce)監控，目前主要的(de)檢(jian)測(ce)手段(duan)是高效液相色譜(pu)法。（HPLC）
本產品是基(ji)于免疫競(jing)爭法(fa)檢(jian)測(ce)原理(li)建(jian)立(li)的(de)一種快(kuai)速定量檢(jian)測(ce)黃曲(qu)霉總量的(de)試劑盒。它具有簡單、快(kuai)速，無需特殊儀器設備等優勢，既可(ke)(ke)以用于實(shi)驗室檢(jian)測(ce)，也可(ke)(ke)在農場、飼(si)料(liao)混合(he)車間等進行實(shi)地測(ce)定。
【適用范圍】
可定性(xing)、定量檢測(ce)玉米、大米、麥類、豆類、花生(sheng)、飼(si)料(liao)、食用(yong)油等樣本中的(de)黃曲霉毒(du)素總量。
【試驗原理】
本(ben)試劑盒(he)采用競(jing)爭(zheng)ELISA，在微(wei)孔(kong)板上(shang)預包被黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉毒(du)(du)(du)素(su)(su)抗(kang)原，加(jia)入樣本(ben)/黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉毒(du)(du)(du)素(su)(su)總量(liang)(liang)標(biao)準(zhun)品(pin)溶(rong)液及辣(la)根過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)(wu)酶標(biao)記(ji)的(de)黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉毒(du)(du)(du)素(su)(su)總量(liang)(liang)抗(kang)體。樣本(ben)或標(biao)準(zhun)品(pin)溶(rong)液中的(de)黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉毒(du)(du)(du)素(su)(su)與(yu)預包被在微(wei)孔(kong)板上(shang)的(de)黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉毒(du)(du)(du)素(su)(su)抗(kang)原競(jing)爭(zheng)結合(he)辣(la)根過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)(wu)酶標(biao)記(ji)的(de)黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉毒(du)(du)(du)素(su)(su)總量(liang)(liang)抗(kang)體。未結合(he)的(de)酶標(biao)抗(kang)體在洗(xi)滌時被除去，再加(jia)入TMB顯色液，讀取吸光值。樣本(ben)的(de)吸光值與(yu)其所(suo)含殘(can)留物(wu)(wu)黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉毒(du)(du)(du)素(su)(su)總量(liang)(liang)的(de)含量(liang)(liang)成負(fu)相關。對(dui)照標(biao)準(zhun)曲(qu)(qu)(qu)線(xian)，即可得出相應殘(can)留物(wu)(wu)黃(huang)(huang)(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉毒(du)(du)(du)素(su)(su)總量(liang)(liang)的(de)含量(liang)(liang)。
【試劑盒靈敏度】
試劑(ji)盒靈(ling)敏度：0.1ppb
【交叉反應率】
結構類似物 交叉反應率
黃曲霉毒素B1 …………………………………………………………… 100%
黃(huang)曲霉毒素(su)B2 …………………………………………………………… 75%
黃曲(qu)霉毒素G1 …………………………………………………………… 100%
黃(huang)曲霉毒(du)素G2 ; …………………………………………………………… 97%
黃曲霉(mei)毒(du)素(su)M1 …………………………………………………………… 30%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標準液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb
3. 酶標物1瓶 ………………………………………… 6ml
4. 顯色液1瓶 ………………………………………… 12ml
5. 終止(zhi)液1瓶 ………………………………………… 10ml
6. 濃縮洗(xi)滌液 （10×）1瓶………………………… 50ml
7. 濃縮樣品稀釋(shi)液（10×）1瓶 ……………………50ml
8. 濃縮樣品稀釋液（10×）1瓶(ping) ……………………25ml
【需要而未提供的設備及試劑】
設備：
┅┅微孔板(ban)酶標儀450nm/630nm
┅┅振蕩器(qi)
┅┅氮吹(chui)儀
┅┅粉碎機
┅┅離心機
┅┅微量(liang)天(tian)平：感(gan)量(liang)0.01g
┅┅微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl、 多道300μl
試劑：
┅┅甲醇（分析(xi)純）
┅┅石油醚
┅┅去離子水（或蒸餾水）
┅┅乙腈
┅┅NaCl
【試劑配制】
1. 樣(yang)品稀釋(shi)液(ye)：將濃縮(suo)樣(yang)品稀釋(shi)液(ye)用去離(li)子水(shui)按1:9體積比進行稀釋(shi)（1份濃縮(suo)樣(yang)品稀釋(shi)液(ye)+9份去離(li)子水(shui)）。
2. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離(li)(li)子(zi)水按(an)1:9體積(ji)比進行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離(li)(li)子(zi)水）。
3. 谷物稀釋液(ye)：將0.9gNaCl用配制完成的樣(yang)品稀釋液(ye)溶解并定容至100ml。
4. 啤酒稀(xi)(xi)釋液(ye)：取無水甲醇(chun)，用配制完成的樣品稀(xi)(xi)釋液(ye)按(an)1:4體積比(bi)進行稀(xi)(xi)釋（1份(fen)甲醇(chun)+4份(fen)樣品稀(xi)(xi)釋液(ye)）。
5. 50%甲醇：取無水甲醇，用去(qu)離(li)子水按1:1體積(ji)比進(jin)行稀釋（1份無水甲醇+1份去(qu)離(li)子水）。
【樣本前處理步驟】
一、 谷物（大米、玉米、小米等低脂含量）（稀釋倍數：8）
1. 取1.0g粉(fen)碎的樣品與8ml 谷(gu)物(wu)稀釋液混合均勻；
2. 強力(li)振蕩3min；
3. 5000g離心(xin)10min；
4. 取上(shang)清(qing)液100μl待測。
二、 蛋糕（稀釋倍數：10）
1. 取(qu)1.0g粉(fen)碎的(de)樣品與(yu)4ml 50%甲醇混合均勻；
2. 強力振蕩3min；
3. 5000g離心10min；
4. 取(qu)400μl下層液體，加入(ru)600μl樣品稀(xi)釋液進行稀(xi)釋，充分混勻；
5. 取100μl稀(xi)釋后液(ye)體待測。
三、 花生、奶油蛋糕（稀釋倍數：10）
1. 取1.0g粉碎的樣品與(yu)4.0ml石(shi)油醚混合均勻；
2. 加入4ml 50%甲醇混合均(jun)勻(yun)；
3. 強力振蕩3min；
4. 5000g離心10min；
5. 取400μl下(xia)層液體(ti)，加入600μl樣(yang)品(pin)稀(xi)釋液進行稀(xi)釋，充(chong)分混勻(yun)；
6. 取100μl稀釋(shi)后液體待(dai)測。
四、 食用油（稀釋倍數：10）
1. 取1.0g樣品與4.0ml石油醚(mi)混合均勻；
2. 加入4ml 50%甲醇混合，振蕩1min；
3. 靜(jing)置10min；
4. 取(qu)400μl下層(ceng)液體(ti)，加(jia)入600μl樣品稀(xi)釋(shi)液進行(xing)稀(xi)釋(shi)，充分混勻；
5. 取100μl稀釋(shi)后液(ye)體待測。
五、 飼料、面粉、湯圓（稀釋倍數：24）
1. 取3.0g粉碎的樣品與9.0ml 80%甲(jia)醇混合均勻；
2. 強(qiang)力振蕩(dang)3min；
3. 2000g離心10min；
4. 取上(shang)層清液100μl，加入700μl樣品稀釋液，混合均勻；
5. 取100μl稀(xi)釋(shi)后(hou)液體待測。
六、 啤酒（稀釋倍數：5）
1. 取200μl啤酒樣品（去除CO2），加入800μl啤酒稀釋液；
2. 振蕩3min；
3. 取100μl稀釋(shi)后(hou)液體待測。
七、醬油、醋、葡萄酒（稀釋倍數：8）
1. 取0.5ml樣品，加入0.5ml蒸(zheng)餾水并加入4.0ml三氯甲(jia)烷；
2. 混勻振蕩3min，5000g離(li)心10min；
3. 取1.0ml下層液(ye)，60℃氮(dan)氣吹干；
4. 加入(ru)100μl乙(yi)腈溶解干燥(zao)物(wu)，并加入(ru)900μl樣品稀釋(shi)液，充分混勻(yun)；
5. 取100μl稀釋后液(ye)體待測。
【檢測步驟】
一、 測定前須知：
1. 使(shi)用之前(qian)將所(suo)有(you)試(shi)劑(ji)和所(suo)需板條回溫（20～25℃）。
2. 使用之后立即將(jiang)所有試劑(ji)及(ji)剩余(yu)板(ban)條(tiao)放(fang)置2～8℃，干燥環境保存(cun)有利于保持試劑(ji)穩定(ding)性。
3. ELISA分析中的再現性，很(hen)大程度上取決(jue)于洗板(ban)的一(yi)致性，正確的洗板(ban)操作是ELISA操作中的要點(dian)。
4. 在(zai)所有恒溫孵(fu)育過程中，避免光線(xian)照(zhao)射，用蓋板膜封住(zhu)微孔板。
二、操作步驟：
1. 將所需試劑(ji)及微孔板(ban)取出，放置(zhi)室(shi)溫(wen)（20～25℃）30min以上，液(ye)體試劑(ji)使用(yong)前均須搖(yao)勻。
2. 取(qu)出(chu)所(suo)需數量的微(wei)孔板(ban)(ban)，將不用的微(wei)孔板(ban)(ban)與干燥劑一(yi)起重新真空密封，放置(zhi)于(yu)2～8℃。不可冷(leng)凍(dong)。
3. 洗滌工作(zuo)液在使用(yong)前(qian)也(ye)需回溫。
4. 將樣(yang)本(ben)和(he)標(biao)準(zhun)品對應微孔(kong)(kong)編號(hao)，每個樣(yang)本(ben)和(he)標(biao)準(zhun)品做2孔(kong)(kong)平行，并記錄標(biao)準(zhun)孔(kong)(kong)和(he)樣(yang)本(ben)孔(kong)(kong)所在的(de)位(wei)置(zhi)。
5. 加標準品/樣本50μl到對應的微孔中，加入酶標物50μl/孔，輕輕振蕩混(hun)勻，用蓋板(ban)膜蓋板(ban)后(hou)置室溫避光反應15min。
6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板(ban)5次(ci)，每次(ci)間(jian)隔30s，用吸水(shui)紙拍干。
7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻(yun)，用蓋板(ban)膜蓋板(ban)后置室(shi)溫避(bi)光反應(ying)15min。
8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混(hun)勻，設(she)酶(mei)標(biao)儀于450nm處讀取(qu)每孔OD值。
【結果判定】
1. 百分吸光率的計算
標準(zhun)品或樣(yang)本(ben)(ben)的(de)百分(fen)吸光(guang)率(lv)等于標準(zhun)品或樣(yang)本(ben)(ben)的(de)百分(fen)吸光(guang)度(du)值(zhi)的(de)平均值(zhi)（雙孔）除以第一(yi)個標準(zhun)（0標準(zhun)）的(de)吸光(guang)度(du)值(zhi)，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—標準溶(rong)液或樣本(ben)溶(rong)液的平均吸光度(du)值
B0—0(ppb)標(biao)準(zhun)溶液的平均吸光度(du)值
2. 標準曲線的繪制與計算
以標(biao)準(zhun)(zhun)品百分吸光率(lv)為縱坐(zuo)標(biao)，黃(huang)(huang)曲(qu)霉毒(du)素(su)總(zong)量標(biao)準(zhun)(zhun)品濃度（ppb）的對(dui)數為橫(heng)坐(zuo)標(biao)，繪制標(biao)準(zhun)(zhun)曲(qu)線圖(tu)。將樣本的百分吸光率(lv)代入標(biao)準(zhun)(zhun)曲(qu)線中(zhong)，從標(biao)準(zhun)(zhun)曲(qu)線上讀出樣本所對(dui)應的濃度，乘以其(qi)對(dui)應的稀(xi)釋(shi)倍(bei)數即為樣本中(zhong)黃(huang)(huang)曲(qu)霉毒(du)素(su)總(zong)量實際量。
【注意事項】
1. 室溫(wen)低(di)于20℃或試(shi)劑(ji)及樣本(ben)沒有恢(hui)復到(dao)室溫(wen)（20～25℃）會導致所(suo)有標(biao)準的(de)OD值偏低(di)。
2. 在(zai)洗板過程中如果出現板孔干(gan)燥的情(qing)況，則會(hui)出現標準曲線(xian)不(bu)成線(xian)性(xing)，重(zhong)復(fu)性(xing)不(bu)好(hao)的現象。所以洗板拍(pai)干(gan)后(hou)應立即進(jin)行下(xia)一(yi)步操(cao)作。
3. 每種(zhong)試劑使用前均需搖勻。
4. 反應終止液(ye)為0.5M硫酸，避免接觸皮膚。
5. 不(bu)要使(shi)用過(guo)(guo)了有(you)效期(qi)的試劑盒(he)；也不(bu)要摻(chan)雜使(shi)用過(guo)(guo)了有(you)效期(qi)的試劑盒(he)；不(bu)要交換使(shi)用不(bu)同批(pi)號(hao)試劑盒(he)中的試劑。
6. 儲存條件：
試(shi)劑盒(he)保存(cun)于2～8℃，不能(neng)冷凍，將不用的微孔板重新真空密封。標準物質和無(wu)色的顯色劑對光(guang)敏感，因此要避(bi)光(guang)保存(cun)。
7. 試劑變(bian)質(zhi)的跡(ji)象：
顯色試(shi)劑有任何顏色表(biao)(biao)明顯色劑變(bian)質，應當棄(qi)之。0標準(zhun)的(de)吸光(guang)度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時，表(biao)(biao)示試(shi)劑可能變(bian)質。
8. 加(jia)入顯(xian)色(se)液后，一般顯(xian)色(se)時間(jian)為(wei)15～30min。若(ruo)顏色(se)較淺，可延長反應時間(jian)到35min（或更長），但不得超過40min。反之，則減短(duan)反應時間(jian)。
9. 該試劑(ji)盒(he)最佳反應溫度(du)為(wei)25℃，溫度(du)過高或過低將(jiang)導致檢測(ce)吸光(guang)度(du)值和靈敏度(du)發生變化。
【樣品最低檢測限】
谷(gu)物 ………………………………………………0.8ppb
蛋糕 …………………………………………………1ppb
花(hua)生、奶油蛋糕(gao)……………………………………1ppb
食(shi)用油(you) ………………………………………………1ppb
飼料、面粉、湯圓………………………………2.4ppb
啤酒 ………………………………………………0.5ppb
醬(jiang)油、醋 …………………………………………0.8ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件：保存試劑盒(he)于2～8℃。
保存期：該產品有效期為12個月。
