嘔吐毒素（DON）ELISA檢測試劑盒說明書
【概要】
脫氧雪腐鐮(lian)刀菌烯(xi)醇(chun)(deoxynivalenol，DON)又稱嘔吐(tu)(tu)毒素(vomitoxin)，主要是由鐮(lian)刀菌的某些產生(sheng)的化(hua)學(xue)結構和(he)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)活性(xing)相似的有(you)(you)毒代謝(xie)產物(wu)(wu)(wu)——單端孢霉烯(xi)族化(hua)合物(wu)(wu)(wu)中的一(yi)種。DON 的主要產生(sheng)菌是禾谷(gu)鐮(lian)刀菌(Fusariumgraminearum)，主要污(wu)(wu)染小麥(mai)、大麥(mai)、玉(yu)米等谷(gu)類作(zuo)物(wu)(wu)(wu)，也污(wu)(wu)染糧(liang)食(shi)制品，人(ren)和(he)動物(wu)(wu)(wu)在(zai)誤食(shi)被該毒素污(wu)(wu)染的糧(liang)谷(gu)類后可(ke)(ke)(ke)以產生(sheng)廣(guang)泛的毒性(xing)效(xiao)應。近(jin)年來(lai)發現DON可(ke)(ke)(ke)能(neng)與人(ren)類食(shi)管癌、IgA腎(shen)病有(you)(you)關。DON屬于劇(ju)毒或中等毒物(wu)(wu)(wu)，人(ren)畜攝入了(le)被DON污(wu)(wu)染的食(shi)物(wu)(wu)(wu)/飼(si)料后，會(hui)導致(zhi)(zhi)(zhi)厭(yan)食(shi)、嘔吐(tu)(tu)、腹瀉、發燒、站立(li)不穩、反應遲(chi)鈍等急(ji)性(xing)中毒癥狀，嚴(yan)重時損(sun)害造(zao)血系(xi)統(tong)造(zao)成(cheng)死亡。研究(jiu)表明(ming)(ming)，DON可(ke)(ke)(ke)能(neng)對免疫系(xi)統(tong)有(you)(you)影(ying)響，有(you)(you)明(ming)(ming)顯胚胎毒性(xing)和(he)一(yi)定致(zhi)(zhi)(zhi)畸作(zuo)用(yong)(yong)，可(ke)(ke)(ke)能(neng)有(you)(you)遺傳(chuan)毒性(xing)，但(dan)無致(zhi)(zhi)(zhi)癌、致(zhi)(zhi)(zhi)突變(bian)作(zuo)用(yong)(yong)。谷(gu)物(wu)(wu)(wu)及飼(si)料中DON的含量有(you)(you)嚴(yan)格的限(xian)量標準。我國谷(gu)物(wu)(wu)(wu)中DON 的限(xian)量標準為1．0 mg／kg 。因此，有(you)(you)必要對其進行有(you)(you)效(xiao)的監(jian)控(kong)。HPLC或GC-MS用(yong)(yong)作(zuo)檢(jian)測(ce)嘔吐(tu)(tu)毒素的方法，但(dan)是其前處(chu)理步(bu)驟(zou)繁瑣，費用(yong)(yong)昂貴。酶聯免疫檢(jian)測(ce)試劑盒則可(ke)(ke)(ke)經濟、快速地檢(jian)測(ce)嘔吐(tu)(tu)毒素。
【適用范圍】
本(ben)試劑(ji)盒(he)可定(ding)(ding)性、定(ding)(ding)量測定(ding)(ding)大米、小米、小麥等(deng)谷物(wu)及飼料中的嘔吐毒素。
【試驗原理】
本試劑盒采用競爭ELISA，在(zai)微孔板上(shang)預包被嘔(ou)吐毒(du)(du)素(su)(su)(su)抗(kang)原(yuan)，加(jia)入樣本/嘔(ou)吐毒(du)(du)素(su)(su)(su)標(biao)(biao)準品溶液及(ji)辣(la)(la)根(gen)過氧化物(wu)(wu)酶(mei)標(biao)(biao)記的(de)(de)(de)嘔(ou)吐毒(du)(du)素(su)(su)(su)抗(kang)體(ti)。樣本或標(biao)(biao)準品溶液中的(de)(de)(de)嘔(ou)吐毒(du)(du)素(su)(su)(su)與預包被在(zai)板孔上(shang)的(de)(de)(de)嘔(ou)吐毒(du)(du)素(su)(su)(su)抗(kang)原(yuan)競爭結(jie)合(he)辣(la)(la)根(gen)過氧化物(wu)(wu)酶(mei)標(biao)(biao)記的(de)(de)(de)嘔(ou)吐毒(du)(du)素(su)(su)(su)抗(kang)體(ti)，未結(jie)合(he)的(de)(de)(de)酶(mei)標(biao)(biao)抗(kang)體(ti)在(zai)洗滌時被除去。再加(jia)入TMB顯色，讀取吸光值。樣本的(de)(de)(de)吸光值與其所含殘留物(wu)(wu)嘔(ou)吐毒(du)(du)素(su)(su)(su)抗(kang)原(yuan)的(de)(de)(de)含量成負相關。對照標(biao)(biao)準曲線(xian)，即可(ke)得(de)出(chu)相應殘留物(wu)(wu)嘔(ou)吐毒(du)(du)素(su)(su)(su)的(de)(de)(de)含量。
【試劑盒靈敏度】
試劑(ji)盒靈敏度：3ppb
【交叉反應率】
結構類似物 交叉反應率
脫氧雪(xue)腐鐮刀菌烯(xi)醇 …………………………………………………… 100%
3-乙酰(xian)基脫氧雪腐鐮(lian)刀菌烯(xi)醇 ……………………………………… 15%
15-O-乙酰脫(tuo)氧雪(xue)腐鐮刀菌(jun)烯醇 …………………………………… 11%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標準液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppb, 3ppb, 9ppb, 18ppb, 36ppb,72ppb
3. 酶標物1瓶(ping) …………………………………………… 7ml
4. 顯色液(ye)1瓶 ……………………………………………12ml
5. 終止液1瓶 ……………………………………………10ml
6. 濃縮洗滌液(ye) （10×）1瓶 ………………………… 50ml
7. 濃(nong)縮樣品稀釋液(ye)（20×）1瓶……………………… 40ml
【需要而未提供的設備】
----微孔板酶標儀450nm/630nm
----振蕩器
----離心機
----粉碎機
----天平：感量0.01g
----微量移液器：單道 20ul～200μl、200μl～1000μl、多道 300μl
【試劑配制】
1. 洗滌工作(zuo)液(ye)：將濃(nong)縮(suo)洗滌液(ye)用去(qu)離子(zi)水按1:9體(ti)積(ji)比進行(xing)稀(xi)釋(shi)（1份(fen)濃(nong)縮(suo)洗滌液(ye)+9份(fen)去(qu)離子(zi)水）。
2. 樣品稀(xi)釋(shi)液(ye)：將(jiang)濃縮(suo)樣品稀(xi)釋(shi)液(ye)用去(qu)離子水(shui)按1:19體積比(bi)進行稀(xi)釋(shi)（1份濃縮(suo)樣品提取液(ye)+19份去(qu)離子水(shui)）。
【樣本前處理步驟】
一、大米、小米、面粉等谷物及飼料Ⅰ（稀釋倍數：50）
1. 取0.1g粉碎好的樣品，加入5ml樣品稀釋液，混勻；
2. 充分振蕩10min；
3. 4000g室溫離心10min；
4. 取100μl上清液體(ti)待測(ce)。
二、大米、小米、面粉等谷物及飼料Ⅱ（稀釋倍數：50）
1. 取20g粉碎好的樣品，加入(ru)100ml水(shui)，混勻；
2. 充分(fen)振蕩10min；
3. 4000g室溫離心10min或定性濾紙過濾；
4. 取50μl上(shang)清液體，加入450μl樣品(pin)稀釋液，混勻；
5. 取100μl上清液體待測。
【檢測步驟】
一、 測定前須知：
1. 使(shi)用之(zhi)前將(jiang)所(suo)有試劑和(he)所(suo)需板條回溫（20～25℃）。
2. 使(shi)用之后立即將(jiang)所有(you)試劑及剩余(yu)板(ban)條放置2～8℃，干(gan)燥環(huan)境(jing)保(bao)(bao)存有(you)利于(yu)保(bao)(bao)持試劑穩定性。
3. ELISA分析中(zhong)的再現(xian)性(xing)，很大程度上取決于洗板的一致性(xing)，正確的洗板操作是ELISA操作中(zhong)的要點。
4. 在所(suo)有恒(heng)溫孵育過程中(zhong)，避(bi)免光線(xian)照射，用蓋板膜封住微孔板。
二、操作步驟：
1. 將所需試(shi)劑及微孔板取(qu)出，放置室(shi)溫（20～25℃）30min以(yi)上，液體試(shi)劑使用(yong)前均須搖勻(yun)。
2. 取出所需(xu)數量(liang)的微孔板(ban)，將不(bu)用的微孔板(ban)與(yu)干(gan)燥劑(ji)一(yi)起重新真空密封，放(fang)置于(yu)2～8℃。不(bu)可(ke)冷凍。
3. 洗滌工作液在使用前也需(xu)回溫。
4. 將樣本和標(biao)準品對(dui)應微孔(kong)(kong)編號(hao)，每個樣本和標(biao)準品做(zuo)2孔(kong)(kong)平(ping)行，并記錄(lu)標(biao)準孔(kong)(kong)和樣本孔(kong)(kong)所在的位(wei)置。
5. 加標準品/樣本50μl到對應的微孔中，加入酶標物50μl/孔，輕輕振蕩混勻(yun)，用(yong)蓋(gai)板膜蓋(gai)板后置室溫避光反應(ying)15min。
6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔(kong)，洗板5次，每次間隔(ge)30s，用(yong)吸水紙拍干。
7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻(yun)，用(yong)蓋板膜蓋板后置室溫避(bi)光反應15min。
8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設酶標儀于450nm處讀取(qu)每孔OD值。
【結果判定】
1. 百分吸光率的計算
標(biao)準品或樣本的(de)百分(fen)吸光率等于標(biao)準品或樣本的(de)百分(fen)吸光度值的(de)平均值（雙孔）除以(yi)第一個標(biao)準（0標(biao)準）的(de)吸光度值，再乘以(yi)100%，即(ji)
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—標準溶液或樣本溶液的平(ping)均吸光(guang)度值
B0—0(ppb)標準溶液的平均(jun)吸光度值
2. 標準曲線的繪制與計算
以標(biao)準品百分吸光率為縱坐標(biao)，嘔吐毒(du)素標(biao)準品濃度(du)（ppb）的對數(shu)為橫坐標(biao)，繪制標(biao)準曲(qu)(qu)線(xian)圖。將(jiang)樣本的百分吸光率代(dai)入標(biao)準曲(qu)(qu)線(xian)中，從標(biao)準曲(qu)(qu)線(xian)上讀出樣本所對應的濃度(du)，乘以其(qi)對應的稀釋(shi)倍(bei)數(shu)即為樣本中嘔吐毒(du)素實際含量(liang)。
【注意事項】
1. 室(shi)溫低(di)于20℃或(huo)試(shi)劑及樣本沒有(you)恢復到室(shi)溫（20～25℃）會(hui)導致所有(you)標準的(de)OD值(zhi)偏低(di)。
2. 在(zai)洗板過程中如果出(chu)現板孔干燥的情(qing)況，則會出(chu)現標(biao)準(zhun)曲線不(bu)成線性，重復性不(bu)好(hao)的現象。所以洗板拍干后應(ying)立(li)即(ji)進(jin)行(xing)下一(yi)步操作。
3. 每種試劑使用前均需搖勻。
4. 反應終止液為2M鹽酸，避免接觸皮膚。
5. 不(bu)要(yao)使用過了(le)有(you)效(xiao)期(qi)的試(shi)劑(ji)盒；也不(bu)要(yao)摻雜使用過了(le)有(you)效(xiao)期(qi)的試(shi)劑(ji)盒；不(bu)要(yao)交換使用不(bu)同批(pi)號試(shi)劑(ji)盒中(zhong)的試(shi)劑(ji)。
6. 儲存(cun)條件：
試劑(ji)盒保(bao)存于2～8℃，不(bu)能冷凍(dong)，將不(bu)用的微孔板重新真空密(mi)封。標準物質和(he)無(wu)色的顯(xian)色劑(ji)對(dui)光(guang)敏感，因此要避(bi)光(guang)保(bao)存。
7. 試劑變質(zhi)的跡象(xiang)：
顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質，應當棄(qi)之。0標準的吸(xi)光度(du)（450/630nm）值小于(yu)0.5（A450nm<0.5）時(shi)，表示試劑可能變質。
8. 加入(ru)顯(xian)色液后，一般顯(xian)色時(shi)間為15～30min。若顏色較淺，可延長反應(ying)時(shi)間到35min（或更長），但不得超(chao)過(guo)40min。反之，則減短反應(ying)時(shi)間。
9. 該(gai)試(shi)劑盒(he)最佳反應溫(wen)度(du)為25℃，溫(wen)度(du)過高(gao)或過低將導致(zhi)檢測(ce)吸光度(du)值(zhi)和靈(ling)敏度(du)發生變化(hua)。
【試劑盒靈敏度】
試(shi)劑盒(he)靈(ling)敏(min)度：3ppb
【樣品最低檢測限】
谷(gu)物、飼料…………………………………………150ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件(jian)：保存試(shi)劑(ji)盒于2～8℃。
保存(cun)期：該產(chan)品有效期為12個月(yue)。
